DDPCR

实验概要

高等生物体内一般有10⁵个基因，在这些基因中通常只有不到15％的基因得以表达，并且在生命代谢的不同阶段，在不同的环境条件下有不同的基因表达，基因表达差异性是生物体性状多样性，适应能力多样性的物质基础。对同一品种在不同环境条件下的基因差异表达研究，可以了解基因与性状间的关系，并进一步确定一些特殊的基因，dd－PCR技术是进年来发展起来的基因差异表达研究的手段之一。该技术利用mRNA3’端具有poly(A)的特点，以T12G、T12C、T12A为3’端引物扩增出cDNA；以10－mer的随机引物为5’引物进行PCR扩增，mRNA不同，随机引物结合位点不同，扩增后的条带长度也不同，通过测序胶电泳即可将差异表达的mRNA找出，进一步通过克隆或作为探针进行杂交即可获得差异基因。

主要试剂

T12G、T12C、T12A、10－mer的随机引物、RT－PCR试剂盒、测序胶、银染系统

主要设备

PCR仪、电泳仪、测序槽、银染设备

实验步骤

1. 总RNA提取(略)

2. 残留DNA的去除

反应体系

          1－5ugRNA

          10×DNA酶缓冲液   2ul

          RNA酶抑制剂       1ul

          无RNA酶的DNase   1u

          加DEPC水   至    20ul

混匀，37℃ 15min 等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，0.3V3M乙酸钠，2V无水乙醇沉淀，冷冻干燥

3. RT    5×RT缓冲液     4ul

         0.2ug总RNA

         10umT12N        1ul

         加DEPC水 至   10ul

     80℃ 1min  42℃ 5min  再加入

         10mMdNTP                2ul

        100mMDTT                 1ul

         50nMMgCl₂              1.3ul

         RNA酶抑制剂(40u/ul)     1ul   

         MMLV(200u/ul)           1ul

         加DEPC水至            20ul

        37℃  1小时， 90℃ 1min

4. PCR  上述RT液               4ul

        10×PCR缓冲液          1ul

        25mM MgCl₂              1ul           94℃    1min

        10mMdNTP              0.4ul           94℃   30’

        dT12M                 0.2ul           40℃   30’     40循环

        10mer随机引物         0.2ul           72℃   45’

        水                    3.9ul           72℃    6min

        Taq酶（5u/ul）       0.1ul

     混匀后，离心，再加上10ul石蜡油，按右边参数扩增。

5. 检测 龈染检测(略)

6. 差异带切割、回收操作(略)

7.  回收差异带二次扩增

       回收的差异带稀释    50－100倍

        10×PCR缓冲液          1ul

        25mM MgCl₂              1ul       94℃    1min    94℃   45’

        10mMdNTP              0.4ul       94℃   45’      42℃   45’

        dT12M                 0.2ul       40℃   45’      72℃   60’

        10mer随机引物         0.2ul      72℃   60’        20循环

        加水至                10ul        20循环        72℃   6min

        Taq酶（5u/ul）       0.1ul

8. PCR片断的再回收和克窿操作(略)