DNA的定量

一、 实验原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8，RNA的比值为2.0， 若DNA高于1.8，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测定。DNA 本身并不产生荧光，但在荧光染料溴化乙锭（EB）插入DNA 的碱基对平面之间并与之结合后，DNA样品能在紫外光的激发下产生桔红色荧光。荧光强度与被结合的EB的量成正比，而被结合的EB的量又与核酸分子长度和含量成正比，使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液的浓度。灵敏度可达1~5ng。由于是基于目测，所以是估计水平。 该方法经济简便，但准确性较低。

二、仪器及试剂

1. 仪器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可见分光光度仪，琼脂糖凝胶电泳设备。

2. 试剂及配制：

5×上样缓冲液：配制10 ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 2 ml
10% SDS 50 ul
50% 甘油 2.5 ml
0.2% 溴酚蓝 10 mg
0.2% 二甲苯青FF 10 mg
加去离子水至10 ml

其它试剂：0.1×TE 、DNA标准液，EB储存液（10 mg/ml），

三、实验步骤

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE对待测DNA样品按1：20或合适的倍数稀释。

（2）开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”时，进入核酸测定窗口

（3）调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。

（4）吸70 ul已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很少，可以用5~7ul的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260和280nm处的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA样品的浓度等。

（5）打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用高纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入下一个待测样品。

（6）DNA纯度：以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值 <1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA 。