DNA提取：为微生物研究扫清障碍

　　近年来，尽管测序技术在快速发展，但DNA提取方法却鲜有改进。对于宏基因组研究，这是必需的一步。然而，许多微生物无法在实验室中培养，这成为分析大量微生物样品的一个主要瓶颈。参与美国NIH的人类微生物组计划(Human Microbiome Project)以及地球微生物组计划(Earth Microbiome Project)的科学家们也面临这一问题。

　　参与这些计划及其他计划的微生物学家使用专门的试剂盒，他们利用机械和化学裂解以及DNA纯化步骤，接着对16S rRNA基因进行PCR扩增，最后测序。但是他们发现，并非所有方法都是相似的，这不但影响结果的质量，还让不同研究之间的结果难以比较。为了解决这些挑战，多个研究小组都在优化DNA提取的效率，并研究不同步骤如何影响DNA的质量和产量。

　　例如，在上月发表在《PLoS ONE》的一项研究中，科罗拉多大学的微生物学家Gilberto Flores及其同事检验了一种由Sigma-Aldrich提供的直接PCR方法(Extract-N-Amp Plant PCR Kit)，开展人体各部位的细菌群落的16S rRNA基因分析。1 而传统方法是先从样品中提取和纯化DNA，接着进行PCR扩增。研究人员将两种方法进行了比较，发现结果相似，包括分类群丰富度、系统发育多样性、单个分类群的相对丰度，以及各部位之间与个人之间在细菌群落组成上的差异。

　　此外，直接PCR方法比传统方法至少快6-8倍，这让它特别适合那些旨在经济高效地分析人类微生物群落的结构和多样性的高通量分析。目前，Flores正利用这种方法来研究不同身体部位的微生物群落如何随时间而变化。不过，这种直接PCR方法可能不适合鸟枪法宏基因组分析，因为它通常需要更大量高度纯化的DNA。

　　捕获多样性

　　除了改善DNA提取步骤的效率，另一个挑战在于分离DNA，它们要能准确代表群落中微生物的多样性。微生物对化学裂解步骤的敏感性不同。例如，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量丰富。因此，DNA提取步骤可能在分离某些类型微生物的DNA时产生偏向。然而，研究人员事先并不知道群落中有哪些微生物，每种数量多少，因此无法判断所使用的方法是否能准确代表样品中的微生物多样性。

　　过去，微生物学家选择DNA提取方法似乎没有明确的理由，而准确代表微生物多样性这个标准也常常被忽视。根据《Science Translational Medicine》杂志的报道，爱达荷大学的微生物学家Larry Forney与合作者研究了阴道细菌群落组成的时间动态变化。2 他们采用特殊方法，以确保他们的分析可准确代表微生物样品的多样性。

　　Forney谈道：“我们很久以前(17年前)就开始优化鉴定阴道微生物组的步骤，困扰我的是人们评估操作步骤有不同的标准，而你听到的大部分是提高DNA的产量。人们基于各种原因选择一种方法――供应商或他们阅读的文献，别人也用过，等等。而我认为更重要的标准是代表性。”

　　为了解决这一问题，Forney和他的团队比较了六种常用的DNA提取步骤。他们使用mock群落，其中包含了数量相同的11种与人类关联的细菌。根据今年3月发表在《PLoS ONE》杂志上的一篇文章，研究人员分析了mock群落中的16S rRNA基因序列，发现六种DNA提取方法在观察到的物种丰度和预计的物种丰度之间都存在明显差异。3 换句话说，没有一种方法能准确代表mock群落的细菌多样性。

　　然而，使用玻璃珠和溶菌酶(mutanolysin)的操作步骤可显著改善细菌群落结构的代表性。总的来说，酶混合物可比单一酶更高效地裂解细胞。

　　研究人员还发现DNA产量与微生物多样性之间没有明显关联，也就是说，那些DNA产量高的试剂盒并不一定能准确反映群落中各种细菌的相对丰度。

　　Forney认为：“如果你有两种细菌的混合物，一种100%裂解，而另一种0%裂解，那么你可能会得到相当多的DNA，但它不能代表样品中的东西。我想做的一件事情是提高对不同方法之间差异的认识，这样人们会考虑他所用的方法，而不是简单地使用现成产品，或价格最低的产品。”

　　黑匣子

　　考虑到不同方法之间DNA产量和代表性的差异，Forney的研究强调了鉴定方法和策略的重要性，以便于样品之间的比较。基于这一理由，地球微生物组计划选择了标准化的DNA提取步骤。项目成员Janet Jansson认为：“为了研究之间的比较，尽可能依靠标准化方法很重要，当然，困难样品除外。”

　　作为一名博士研究生，Jansson开发出从土壤中提取DNA的步骤，与市售试剂盒的产量相似。因此，她也将这一步骤用于人类粪便和生物活检样品。“土壤是最困难的样品类型。如果你能从土壤中获得DNA，那么你几乎能从任何东西中获得DNA。”

　　Jansson认为玻璃珠裂解是最好的机械破碎法，可提高DNA产量以及细菌群落的代表性。不过，它也会将基因组DNA打成小片段，在后续PCR反应中引入偏向。此外，近期一项发表在《Journal of Microbiological Methods》的研究发现，这种机械破碎方法会降低从肠道组织中提取的DNA的质量。4

　　在这项研究中，玻璃珠增加了微生物DNA的量，但似乎也增加了宿主DNA的量。让人奇怪的是，玻璃珠裂解降低了从革兰氏阳性菌中提取的DNA量。这表明，相对轻柔的机械破碎法(如涡旋)，再加上化学处理，才能裂解肠道组织的微生物细胞。文章的通讯作者，伊利诺伊大学宿主-肠道微生物相互作用的专家 H. Rex Gaskins认为：“玻璃珠可能对这些样品太过剧烈。”

　　尽管这些工作比较了不同DNA提取技术的效果，但微生物学家仍然面对巨大的未知数。Jansson将样品比喻成“黑匣子”。他谈道：“当你有一个未知样品时，你知道肯定有偏向，但除非你对样品中的每种生物测序，否则你永远不知道偏向是什么。因此，你无法知道是否从每个细胞中提取出DNA。这仍是一个主要的障碍，我真的不知道如何去解决。”