DNA的测序技术4

３，染色，将胶板移至染色液中，摇床震荡３０分钟。

４，凝胶洗涤，将染色后的胶板，放入超纯水中２－３秒后，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的显影液中（用量为总量的1/2），充分震荡，当第一批条带后，把胶板移入预冷的另一半显影液中，震荡，直至全部条带出现。

注意：从放入水到放入显影液中，之间时间不超过５－１０秒。

５，终止显影，在显影液中直接加入等体积的固定/终止溶液（第一步操作时用过的），停止显影反应并固定影象。

６，洗涤凝胶，在超纯水中洗涤凝胶２次，每次２分钟。

７，胶板干燥，将显影后的胶板置于室温下，自然干燥。

８，干燥后的胶片可以永久保存，或进行拍照或进行EDF胶片拷贝。

（五）EDF胶片拷贝

EDF胶片拷贝能增强条带的显色强度

1:在暗室中将干燥后的胶板置于光源上(胶面向上)

2:裁一条EDF胶片,进行曝光时间的确定

3:在红灯下,找到EDF胶片上有缺刻的一角,然后把EDF放于胶上,有缺刻的位置为左上角.在EDF上再放一干净的玻璃板。

4:根据以确定的曝光时间,对EDF曝光。

5:显影 在Kodax GBX显影液中显影1-5分钟

6:水洗1分钟

7:在Kodax GBX中定影3分钟

8:水洗1分钟.

9:烤干。

注意:

1： 鲨鱼齿插入深度不能过深,否则可上样量少,也不能过浅,否则易造成点样槽渗漏,一般插入深度以0.5毫米为好。2：一定要进行预电泳,其作用为提高胶的温度,防止DNA单链间的胶连3：上样前应用1毫升枪吸打上样孔,吸取样品应尽量不把上层矿物油带入,加样动作要快,以防止扩散。4：本实验所有部分尤其是（三），（四）、（五）三部分操作中一定要戴手套。

附录1：未知模板的用量

[200bp(PCR产物) 16ng]

[3000-5000bp（超螺旋质粒DNA4μg]

[48000bp(λ或粘粒DNA 1μg]

2：测序反应中所用聚合酶的特性

酶 持续合成能力bp 聚合速率bp/秒

Klenow片段 15-20 45

AMV 未测 5

测序酶 2000 300

Taq酶 >7600 35-100

3：引物设计要求

1):碱基组成应匀称，G+C含量为40-55%，长度为１８聚。如G+C含量在此值外，则长度应为18+n/2,对于AT丰富区，n=50-(G+C)%；对于GC丰富区，n=(G+C)%-50。2)，引物中不应含二重对称区，以防止形成发夹或颈环结构。3):引物纯度至少要到电泳级

4:各种溶液组成

5:ddNTP与dNTP的组成比例