DNA测序概念再升级：新方法每秒识别660亿碱基

　　DNA测序经历了Sanger测序、二代测序（高通量测序）及三代测序（纳米孔测序），日前，美国国家标准与技术研究所（NIST）模拟了一个新型基因测序概念：通过将DNA分子从微小的、具有化学活性的石墨孔洞中拉动，通过测量石墨孔洞边缘产生的电位变化来实现高速、高精度、高效率的DNA测序；研究人员表明，该方法每秒可识别660亿个碱基，准确度为90%且无假阳性；如果该方法通过实验验证，那么将比传统的测序方法速度更快，成本更低。相关研究结果于近日发表于《Nanoscale》杂志上。

　　图：NIST新型DNA测序原理模型（来源Science Daily）

　　NIST提出的新型DNA测序方法与纳米孔测序原理的延伸，依赖于带电粒子（离子）通过纳米孔道引发电位变化。尽管一直以来都受欢迎，但带电粒子（离子）通过纳米孔道引发电位变化也面临很多挑战，如不必要的电信号噪声、干扰以及选择性不足。为了克服这些困扰，NIST提出的新建议是创建临时的化学键和依赖于石墨烯的能力打破这些化学键，并将产生的机械应变信号转变为电流信号。引领该项目的NIST理论家Alex Smolyanitsky说，“这本质上是一个微型压力传感器，我们并没有发明一个完整的技术，只是提出了一个新的物理原理。”

　　由于电气性和微型薄膜结构，石墨烯在纳米孔测序中很受欢迎。在NIST提出的新方法中，单层石墨纳米带（4.5*15.5nm）附有多个纳米通道（宽度为2.5nm）。于室温下在水中模拟传感器的工作原理：胞嘧啶可附着在纳米孔中，通过碱基配对原理可检测出鸟嘌呤；单链DNA分子可通过纳米孔；当鸟嘌呤通过孔道时，与胞嘧啶形成氢键；随着DNA单链在孔道中移动，石墨烯被猛拉再滑回到原来的位置，氢键断裂，从而机械应变信号转变为电流信号。

　　NIST的研究主要集中于DNA链如何影响石墨烯的电学性能，并发现临时的电流变化确实发生在目标碱基通过孔道的瞬间。为了能检测ACTG四个碱基，拥有不同插入孔的四个石墨烯带需垂直堆叠以创建一个集成的DNA传感器。

　　研究人员将模拟数据与理论想结合起来评估可测信号的变化水平。结果发现信号强度在毫安范围，比早期的离子电流纳米孔方法要强些。基于90%的准确率和无假阳性，研究人员认为DNA链四个碱基的独立检测可使准确率达99.99%，这个准确率也是人类所需的。

　　作者最后得出结论：该方法提供了一个无需先进的数据处理、显微镜或高度受限的操作环境便可实现DNA传感的技术。除了将碱基附着到纳米孔上，其他所有的传感组件均已被其他研究小组的试验证实。理论分析表明基本的电子过滤方法可以过滤有用的电信号，该方法将同样可用于其他应变敏感膜，如二硫化钼。

　　回顾纳米孔测序

　　新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方 法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对 于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以 使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。

　　1996年哈佛大学的Daniel Branton、加州大学的David Deamer及其同事，在美国国家科学院院刊PNAS杂志上首次发表文章指出，可以用膜通道检测多核苷酸序列。2005年，Bayley、Gordon Sanghera和Spike Wilcocks创立的Oxford Nanopore公司正式登场。为了开发稳定可靠的纳米孔测序平台，该公司从2007年开始研发以蛋白为基础的纳米孔测序系统。2012年，该公司在AGBT(基因组生物学技术进展年会)上发布了自己的纳米孔系统——MinION，从此纳米孔测序真正实现了商业化。然而，纳米孔测序目前还处于发展初期，错误率等技术问题还有待突破。