DNA片断的树脂回收技术

实验概要

目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片断。目前待回收的片断主要有酶切片断和各种PCR片断；回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、微量柱回收、玻璃奶回收、液氮冻冻融回收及透析袋大量回收等，下面分别介绍树脂、微量柱及液氮冻冻融回收技术。
树脂回收特别适合于PCR片段的回收，具有纯度高、操作简洁等特点，经此方法回收的片段可有效的用于重组载体构建。通过15分钟的纯化过程，PCR产物即能被有效地从含引物二聚体、非特异性扩增引物片断等混合物中分离出来，成为高度无盐的、不含其他大分子成分的纯化片断。在较宽的分子量范围内有较高的回收效率。下表为不同长度的DNA片断，在室温条件下，用此纯化系统直接纯化时，各自相应的回收率。

dsDNA长度bp     200        1500            300              200              75                50

回收率%           ≥ 60          96                99                69                3                  2

主要试剂

PCR片断纯化试剂盒  80％异丙醇

主要设备

离心机  电泳议  电泳槽  取液器  微量真空装置  抽滤装置

实验步骤

1. 从琼脂糖介质中纯化DNA片断

   1) 用低熔点或常规熔点琼脂糖电泳对PCR扩增片断进行分离，该电泳安常规方法进行，缓冲液为TAE.

   2) 在凝胶上，找到所需条带，然后用洁净并灭菌的小刀将其切下接近300微升琼脂糖凝胶 (约300毫克)

   3) 如果切下的琼脂糖为高融点的则安下面A步骤进行，如为低融点琼脂，则安B步骤进行。

      A. 将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，加入1毫升纯化用树脂，然后将其置于65℃水浴保温5分钟，或保温至琼脂完全溶解。

      B. 将300微升琼脂块放进1.5毫升的微量离心管中，然后将其置于70℃水浴保温至琼脂完全溶解，然后加入1毫升纯化用树脂到融化好的琼脂中，将其混合20秒，但不要振动。

    4) 为每一个待回收片断准备好一个微量柱. 在每个柱的开口处，联上一针筒，然后将这些柱与针筒的复合体与抽真空设备相连

   5) 在柱-针筒复合体中加入树脂/DNA混合物，打开真空装置，将树脂与DNA的混合物抽到 微量柱中，断开真空装置与柱的连接。

   6) 洗柱，加入2毫升80%的异丙醇，打开真空装置，使这些洗柱液完全流经微量柱。

   7) 继续真空30秒以干燥树脂，注意此干燥时间不能超过30秒。关闭真空，移去针筒。将微量柱转移至一1.5毫升微量离心管中。10000g离心2分钟，以彻底除去残存的异丙醇。

   8) 将微量柱，再转移至一新的1.5毫升微量离心管中，加入50微升水或TE缓冲液，静置1分钟(在头30秒，DNA仍将吸附于柱上)，10000g离心20秒，以洗脱DNA片断，所得纯化后的DNA片断可直接用于连接反应或在-20℃保存。
2. 尿素丙烯酰胺变性胶中分离DNA片断

   1) 从变形胶上切下待回收片断，将其放如一微量离心管中。

   2) 加入100微升TE缓冲液，37℃保温30分钟以上。

   3) 将上清液吸入一新管中，加入1毫升树脂，振荡20秒以混匀树脂与清液。

   4) 其余步骤同1。

注意事项

1. 对于>3Kb的片断在纯化回收时，洗脱前，如先将水或TE缓冲液预热到65-80℃，则将能有效的提高回收率。待洗脱片断>3Kb时，洗脱液温度应为65-80℃;待洗脱片断>20Kb时，洗脱液温度应达80℃。

2. 应用TAE缓冲液，而不应用含TBE的胶，因硼酸能与琼脂糖中的方式糖单体或多聚体结合成难溶复合物，这种复合物使胶难熔解。

3. 在取用纯化柱树脂中的液体前，应将树脂充分搅匀，如树脂中出现结晶或结块，则应将树脂在25-37℃，温热10分钟，冷却至30℃使用。树脂本身不会溶。

4. 在紫外光下观察切割条带时，操作要快，DNA条带在紫外光下的暴露时间应尽量短，因UV会引起DNA变异。