DNA片段的亚克隆实验

DNA

CIP dNTP DNA聚合酶 T4聚合酶 DTT ATP

水浴锅 电泳仪 培养箱

1.  在20 μl 反应体积内用合适的酶完全消化DNA。75℃加热15 min，灭活酶。如若无需进一步的酶促处理，接歩骤6。

2.  如果5’磷酸需要去除，加入2 μl 10×CIP缓冲液和1 U CIP，37℃温育30~60 min，75℃加热15 min终止反应。如无进一步的酶促处理，接步骤 6。

3.  如果1个或2个末端需变为平端，加入1 μl 含4种dNTP混合液（每种0.5 mmol/l） 和适量klenow酶或T4 DNA聚合酶，温育（见图一），75℃加热15 min 化终止反 应。如果只需1个平端，可用适当的酶消化。如无进一步的酶促处理，接步骤6。

4.  若需加人寡核苷酸接头，加入0.1~1.0 μg 的合适的寡核苷酸接头，1 μl 10 mmol/l ATP，1 μl 0.2 mol/l DTT，20~100粘性末端单位的T4 DNA连接酶，15℃过夜， 75℃加热10 min 以终止反应。

5.  用识别接头的限制性内切酶切割步骤4的产物。如果两个末端只有一个含有接头，产 物加入另一种酶切割。

6.  用琼脂糖凝胶电泳分离所需的片段，在紫外灯下，切下所需条带，纯化DNA。

7.  建立以下连接反应

（1）9 μl  DNA成分（0.1~5 μg）

（2）10 μl  2×链接缓冲液

（3）1 μl  10 mmol/l ATP

（4）T4 DNA连接酶（20~500粘性末端单位）

（5）15℃温育24 h

8.  取1~10 μl 连接产物转化感受态大肠杆菌，利用载体上的遗传标记选择重组子。

9.  用小量制备法纯化质粒或噬菌体DNA，用限制性内切酶作进一步分析。
 

图一、非匹配末端的DNA片段的连接


图二、平端DNA与EcoR Ⅰ接头连接