DNA的琼脂糖凝胶电泳实验

DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有的电荷效应和分子筛效应。

电荷效应是指DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电，在电场中向正极移动，且相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，能以相同速率移动。通常，DNA泳动速率随DNA片段长度的增加而减少，与电场强度成正比。

分子筛效应是指作为支持介质的琼脂糖，具有网络结构，使大分子物质在通过时收到较大阻力，依此分离不同大小的DNA片段。一般，DNA琼脂糖凝胶电泳可分离50bp到百万bp长度的DNA片段，视实际需求配制不同浓度和构型的琼脂糖凝胶。

DNA片段

琼脂糖 电泳缓冲液（1XTAE或0.5XTBE） 载样缓冲液 荧光插入染料（溴化乙锭或SYBR Gold） DNA大小标准品（DNA Marker）

琼脂糖凝胶电泳仪 紫外透射仪或紫外凝胶成像仪 微波炉 移液器 水浴锅

1.  用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；

2.  调整好梳子的高度；

3.  称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至45-50篊时倒入制胶板中；

4.  凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；

5.  将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；

pUC185祃+ddH₂O₃祃+溴酚蓝2祃共10祃于0.5 ml tube中混合后点样；

6.  将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；

7.  电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5礸/ml的溴化乙锭（EB）溶液中染色10－15min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。

1.  影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：

（1）DNA分子大小与迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA）

（2）胶浓度，U为迁移率，U0t 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNAt为DNA的自由电泳迁移率，
 

（3）DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。

（4）所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5 V/cm

（5）碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃

（6）嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)

（7）电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2.  溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。

3.  电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

常见问题原因分析

1. 跑出的DNA带模糊？

（1）DNA降解：避免核酸酶污染。

（2）电泳缓冲液不新鲜：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

（3）所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应<15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

（4）DNA上样量过多：减少凝胶中的DNA上样量。

（5）DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

（6）有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

（7）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

2. 有不规则DNA带迁移？

（1）对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

（2）电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

3. 跑出的DNA条带弱或无条带？

（1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。

（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

（3）DNA走出凝胶：正确连接电极方向避免插反的情况，缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

（4）所用光源不合适：对于用EB染色的DNA应用短波长（254nm）紫外光源。

4. 跑出的DNA带缺失不完整？

（1）如果是小DNA带，可能跑出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

（2）分子大小相近的DNA带不易分辨，应延长电泳时间，并核准正确的凝胶浓度。

（3）DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

实验方法出处来源《分子克隆实验指南