DNA结合蛋白测定实验

质粒DNA

dNTP DNA聚合酶 Klenow酶 TE TAE 溴化乙锭 TEMED 过硫酸铵 BSA

培养箱 离心管

1.  用一种或多种限制性内切酶在100 μl 体积中消化10 μg 质粒人，产生25~100 bp  的含有结合位点的DNA片段，并至少有一端是5’突出的。

2.  加100 μCi［α-³²P］dNTP，4μl 5 mmol/l 3种NTP的混合液，2.5U Klenow酶。室温温育20 min。
 

3.  加4 μl 含有5 mmol/l 与被标记的相同的dNTP溶液，室温温育5 min。

4.  沉淀DNA，溶解于TE中。

5.  加10×加样缓冲液，用2%小型琼脂凝胶（含溴化乙锭5 μg/ml）在TAE或TBE缓冲液中进行电泳。

6.  在长波透射紫外灯下观察电泳带。在带的下游切一平行缝隙，插入一片DEAE膜（先在凝胶缓冲液中浸湿）。将膜紧挤于胶中，继续电泳直到泳动至膜上。

7.  将膜在电泳缓冲液中洗一下，在滤纸上吸干。将膜放入1.5 ml 螺口盖的圆底管底部，其中装有400 μl DEAE洗脱液，68℃水浴30 min。

8.  将洗脱液移入1.5 ml 的离心管中，4℃微量离心15 min。将上清转入干净管中，留10 μl 于原管管底。

9.  在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl₂。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA，重悬于100 μl TE缓冲液中。

10.  取1 μl 测定cpm/μl min，用溴化乙锭打点法定量估计DNA浓度。

11.  安装16 cm 长的电泳玻璃板和1. 5 mm 厚的垫片。在40 ml 低离子強度凝胶混合液中加100 μl 30%的过硫酸铵及34 μl TDMED，灌入玻璃板之间，插入齿宽≥7 mm 的梳子。让胶聚合20 min。

12.  将梳子和底边的垫片取出。将胶放入盛有低离子强度电泳缓冲液的电泳漕中，用双头泵以5~30 ml/min 循环电泳缓冲液。100 V（约22mA）预电泳90 min以上， 

13.  在微量离心管中，加终体积15 μl 的下列成分：10 000 c/min 的DNA探针，终浓度300 μg/ml BSA，及取自缓冲液中的粗制蛋白提取物中的大约15 μg 蛋白质。混匀，置30℃水浴15 min。

14.  在1个加样孔加入少量10×加样缓冲液并让染料跑进胶。在其他孔中加各结合反应液，在约30~35mA下电泳，直至溴酚蓝（相当于约70 bp 的条带）达到胶底。

15.  卸下凝胶电泳装置，撬开电泳玻璃板，将粘附了凝胶的玻璃板平放在实验台上，在胶上放置3张Whatman 3MM滤纸。将滤纸连同凝胶一起揭下。

16.  用塑料薄膜包裹凝胶进行真空干燥。在不使用增感屏的条件下，凝胶膜放射自显影过夜，或用增慼屏放射自显影2~3 h。

1. 目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25bp）,这样结合位点可和其他因子的结合位点区别开。长的限制性酶切片段可用于对推定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位。随后可用DNaseI 印迹对蛋白结合的特异区域在DNA序列水平上作出分析。

2. 凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影， 或用PhosphorImage分析。

3. 凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH, 聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白， 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20uL）。