DNA的转化实验

体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，DNA可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增DNA所不能替代的。配合DNA重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。

质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转化效率可达１０５－１０７转化子/μg DNA。获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。pUC18的LacZ基因区域当有DNA   片段插入时，LacZ基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时，会产生白色的克隆，不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。

DNA分子转化分以下几步：

1、 吸附--双链DNA分子吸附于受体菌表面；

2、 转入--双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；

3、 自稳--外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；

4、 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

实验试剂：

LB培养基
质粒DNA（含Amp抗生基因），受体菌
CaCl2 0.1M
Amp

实验过程：

1、 感受态细胞制备及CaCl2处理：

1） 将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。
2） 挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。
3） 从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。
4） 培养物于冰上１０分钟。
5） 转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。
6） 弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。
7） 4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。
8） 加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。

2、 倒皿铺平板 ：

1） 按照各组转化反应的混合物，控制不同的选择性培养基（20 ml/皿） 。LB固体培养基（100 ml） Amp（60μg/ml） Tet（40μg/ml）供连接混合物转化，pUC18转化用, 共5皿 LB固体培养基 （100 ml） Amp （60μg/ml） X-gal （40μg/ml） IPTG（24μg/ml）,供连接混合物转化，pUC18转化用,共5皿 。
2） 转化反应前一天，先铺好平板 。
3） 取各组反应物在平板上涂布 。
4） 培养皿倒置于37℃培养箱中过夜 。
5） 观察转化子出现的情况 。

3、 转化：

1） 将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，温和混匀，于冰上３０分钟

2）于４２℃水浴９０秒。
3） 冰浴２分钟。
4） 加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分钟。
5） 分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。

注意事项：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。