DNA重组技术－连接

实验概要

        体外连接获得重组分子，用于转化受体细胞。

实验原理

    质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，  然后体外使两者相连接， 再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中，  如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段   用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端  用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。  由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，  而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度，  以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，  最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.  coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

3、带有平末端  是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补   平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4  DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG  8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。

         特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配，  也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

主要试剂

        T4 连接酶、无菌水、PUC/λDNA（酶切产物）。

主要设备

        微量移液枪，Tip、eppendorf管。

实验步骤

 连接反应　　　

                 PUC  (酶切产物)     5ul

                 λDNA (酶切产物)    5ul

                 T4 ligase                  1ul

                 10x buffer                 1.5 ul

H2O                          2.5 ul

                -------------------------------

Total                    15ul

16℃连接过夜，第二天可用于转化筛选转化子。 

注意事项

        进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为Ligase酶很容易降解。一般14-16℃,O/N.