DNA结合蛋白的凝胶阻滞分析实验

作为对照的核提取物或蛋白组分 核提取物或蛋白组分

Ficoll 400 聚乙烯醇 蔗糖染色液 10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液 4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝胶 poly(dI-dC) 32P标记的对照DNA 32P标记的靶DNA

杂交膜

材料

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录1。
贮存液需稀释到适当浓度。

Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll溶解在无菌水中，分裝成100ul并冻存在-20°C。

聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在无菌水中, 分装成100ul并冻存在-20°C。

蔗糖染色液
0.25%(m/V)溴酚兰
0.25%(m/V)二甲苯青
40%(m/V)蔗耱（葡萄糖）
溶解于水，用0.22um滤器过滤；贮存于室溫或4°C。

10X Tris-氨基乙酸或Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液

凝胶
4%~7% 中性聚丙烯酰胺凝胶（厚度≤1.5 mm)

核酸和寡核苷酸

poly(dI-dC)(lmg/ml)
适量poly(dI-dC)溶于无菌水中，每管分装100ul并冻存在-20°C。关于poly(dI-dC)在凝胶阻滞试验中的作用的更多信息请见信患栏poly(dI-dC)部分。

放射性化合物

³²P标记的对照DNA

³²P标记的靶DNA>20bp[比活性≥2.5x10⁷cpm/吨（≥5000cpm/fmol)]
DNA 片段标记可以通过磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶补平 3'-退缩末端（第 9 章方案 10, 或第 10 章方案 7); 或用 PCK 方法使带放射标记的核苷酸播到探针中（第 8 章方案 1)。最后一种方法最快，提供的探针比活性也最高有关怎样标记 DNA 探针的建议，请见本方案末尾的栏目：疑难解析及凝胶阻滞分析试验的优化。

特殊设备

杂交膜

细胞和组织

作为对照的核提取物或蛋白组分

核提取物或蛋白组分
用方案 1 中介绍的任意一种方法制备提取物。在兔网织红细胞裂解物或麦胚提取物中进行体外翻译得到的蛋白也可以用来作为 DNA 结合蛋白。如果是后一种情况，通常用 1~20ul 蛋白来替代核提取物。



方法

1. 在无菌的 1.5 ml 离心管中加入:
³²P 标记的靶 DNA                             1ng(1~10fmol)
1 mg/ml poly(dI-dC)                           1ul
核提取物（5~10ug）                         ≤10ul
或者
蛋白组分                                            ≤10ul
20%Ficoll 400                                    5ul
或者
10% 聚乙烯醇                                    4ul
H₂O 加到 20ul



2. 反应管离心几秒钟使反应混合物沉到管底。冰浴 10~30 min。

3. 每管加入 3ul 蔗糖染色液。样品加到 4%~7% 中性聚丙稀酰胺凝胶中。

4. 在 0.5XTris-甘氨酸缓冲液或 0.5XTBE 缓冲液中跑胶，200~250V,20mA,≥2 h。
根据结合蛋白的不稳定性和结合反应的亲和性，有时候可能需要在 4°C 跑胶。

5. 电泳完成后，撬开凝胶板，把凝胶转到一片结实的杂交膜上，在干胶机上干胶约 1 h。

6. 用干胶对 X 射线胶片在-20°C 曝光≥1h, 使放射标记的 DNA 片段显现出来。丰度低一些的 DNA-蛋白复合物用磷屏图像分析大约 1~3 h 就可以检测到。