| 实验步骤 |
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的组成请参见附录 1。贮存液需稀释到适当浓度。
细胞匀浆缓冲液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mml/LMgCl2
10mmol/LKCl
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
含 0.05%(V/V)NonidetP-40 的细胞匀浆缓冲液
细胞重悬缓冲液
40 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
0.4mol/LKCl
1 mmol/LDTT
10%(V/V) 甘油
0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟
0.1%(m/V) 抑蛋白酶肽
缓冲液贮存于 0°C
细胞淋洗缓冲液
40 mml/LTris-Cl(pH7.4)
1 mmol/LEDTA
0.15mol/LNaCl
缓冲液贮存于 0°C。
乙醇
Ficoll 400(20%m/V)
Ficoll 溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。
甲酰胺染色液
10 ml 甲酰胶
10 mg 二甲苯青 FF
10 mg 溴酚兰
贮存于室溫。
MgCl2/CaCl2 溶液
10 mmol/LMgCl2
5 mmoI/LCaCl2
溶液过滤除菌并贮存于室温。
NaCl(5mol/L)
NonidetP-40(0.05%V/V)
酚：氯仿
不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS)
聚乙烯醇（10%m/V)
聚乙烯醇溶解在无菌水中，分装成 100ul 并冻存在-20°C。
终止液
20 mmol/LEDTA（pH8.0)
1%(m/V)SDS
0.2mol/LNaCl
125ug/ml 酵母 tRNA
组织匀浆液
10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.6)
25 mmol/LKCl
0.15 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 亚梢胺
1 mmol/LEDTA(pH8.0)
2mol/L 蔗糖
10%(V/V) 甘油
该缓冲液在使用前需要冰浴预冷。根据需要，步骤 1 前要加人 0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF)、1ug/ml 亮抑酶肽、1ug/ml 抑胃酶肽等蛋白酶抑制剂。
组织重悬缓冲液
5 mmol/LHEPES-KOH(pH7.9)
1.5 mmol/LMgCl2
0.5 mmol/LDTT
0.5 mmol/L 苯甲基磺酰氟
26%(V/V) 甘柚
贮存于 0°C。
台盼蓝染料（0.4%m/V)
取一定量的染料溶于不含 Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS) 中。室温贮存。
酶和缓冲液
DNA 酶 I(lmg/ml)
酶溶于 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）, 分装成小份并冻存在-20°C。恰好在步骤 3 以前把溶液以 1:100稀释于冰浴的 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)。
凝胶
6% 或 8% 的变性聚丙烯酰胺测序胶（见第 12 章方案 8)
核酸与寡核苷酸
poly(dI-dC)(lmg/ml)
取一定量
poly(dI-dC) 溶解在无菌水中, 分装成 lOOul 并冻存在-20°C。加入核酸聚合物是为了减少蛋白与放射性标记 DNA
片段的非特异性结合，结合反应中 poly(dI-dC) 的最佳浓度 (通常为 0~100ug/ml)
需要靠经验确定。其他可用于减低非特异性结合的核酸包括剪切过的基因组 DNA(例如来自子
E.coli、鲑鱼精子或小牛胸腺）、tRNA、剪切后或限制性酶切后的质粒 DNA、poly(dA-dT) 和 poly(dG-dC)。
测序胶长度标准品
通常由靶
DNA 片段进行 Maxam-Gilbert 测序实验中的（A+G) 反应组成。化学测序的方法请参见第 12 章的方案
7。此外也可以使用双脱氧终止法测序反应（第 12 章，方案 3~6), 所用 DNA 的 5'端与 DNA 酶 I 切割得到的 DNA
片段的放射性末端相同。
放射性化合物
32P 末端标记的 DNA[长度 200~500bp, 比活性≥2.5X107cpm/ug(≥5000cpm/fmol)]
DNA
片段的末端标记可以通过以下方法完成：磷酸化（第 9 章方案 13~16, 或第 10 章方案 2); 用 DNA 聚合酶补平 3'-缩进的末端
(第 9 章方案 10 和 11, 成第 10 章方案 7）；或用末端标记引物进行 PCR 反应（第 8 章方案 1)
后一种方法更为快速，不依赖于限制性酶切位点，并允许 DNA 结合位点位于末端标记有关的多个位置。不管用何种方法作放射性标记，DNA 片段用于
DNA 足迹反应前部需要用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
反应中使用的 DNA 片段长度应该为 200~500bp。感兴趣的结合位点至少离放射标记末端 30bp。如果使用更长的 DNA 片段，测序胶的分辨率会变弱。结合位点离末壩太近可能不被 DNA 结合蛋白或 DNA 酶 I 识别。
离心机和转头
Beckman SW28 转头或类似产品，预冷到 4°C
Sorvall Hl000B 转头或类似产品，预冷到 4°C
特殊设备
沸腾的水浴锅
带 B 型研杵的 Dounce 匀浆器
晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管
橡胶棒
辅助试剂
本方案步骤 7~10 需要列在第 12 章方案 8、11 和 12 中的试剂
细胞和组织
新鲜组织、培养的细胞、来自细胞或组织的蛋白成分
方法
1. 用下列 3 种方法中的一种制备核提取物。此外，纯化细胞蛋白得到的组分可以直接用于步骤 2。
从组织制备核提取物
a. 解剖 10~15 g 组织并剪碎。加入冰冷的组织匀浆缓冲液，使碎组织的体积调整到 30 ml。用带紧型研杵的 Dounce 匀浆器勻浆，直到镜检确定大于 80%~90％ 的细胞已经破碎。
b. 检测裂解情况是用 10ul 细胞悬液加相同体积 0.4% 台盼蓝染液，在装有 20 倍物镜的显微镜下观察溶液。裂解的细胞吸收染液，被染成蓝色，而完整的细胞不被染色，仍然是透明的。继续进行组织匀浆直到大于 80%~90% 的细胞已经破碎。
C.
匀浆物用冰冷的组织匀浆缓冲液稀释到 85 ml。在晶型塑料或超明亮型吊桶式离心管中放入 10 ml 冰冷的组织匀浆缓冲液，取 27 ml
稀释的匀浆物铺在上面。以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min）在 4°C 离心 40 min。
d. 去掉上清，离心管倒置 1~2 min 使溶液流干。然后把离心管放在冰上。
(可选）用剃须刀刀片切掉管子上部 2/3, 把带有细胞核的余下 1/3 放在冰上。
e. 用 2 ml 冰冷的组织重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积，加入冰冷的 5mol/LNaCl，使终浓度为 300 mmol/L。轻轻混匀悬浮液，然后冰浴 30 min。
f.
以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是 24000r/min）在 4°C 离心 20 min
回收细胞核。小心地把上清转移到新鲜管中。上清分装成 100~200ul 的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻，并贮存在液氮中。
g. 用 Bradford 法测定上清液的蛋白浓度。
从培养细胞中制备核提取物
a. 从培养瓶、培养血或培养孔中收获 0.5X108~1X108 细胞。在室溫下以 250 g(用 Sorvall Hl000B 转头是1100r/min) 离心收集细胞。用不含 Ca2+的磷酸盐缓冲液洗细胞若干次。
b. 用 5 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀。冰浴 10 min，然后如前离心收集。
c. 用 3 倍体积冰冷的含有 0.05%(V/V)Nonidet P-40 的细胞匀浆缓冲液重悬细胞沉淀，用带有紧型研杵的 Dounce 匀浆器击打 20 次使细胞匀浆。在细胞胀大裂解并释放出完整细胞核的匀浆过程中，匀浆器要埋在冰里。
d.
在 4°C 以 250 g(用 Sorvall H1000B 转头是 1100r/min) 离心收集细胞核，去掉上清，用 1ml
细胞重悬缓冲液重悬细胞核沉淀。精确测量重悬细胞核溶液的体积，加人冰冷的 5 ml/LNaCl, 使终浓度为 300
mmol/L。轻轻混匀悬浮液，然后冰浴 30 min。
e. 以 103900 g(用 Beckman SW28 转头是
24000r/min) 在 4°C 离心 20 min 回收细胞核。小心地把上清转移到一个预冷的新鲜管中。上清分装成 100~200ul
的小份。留下一份用来做蛋白浓度测定。其他的用液氮速冻，并贮存在液氮中。用 Bradford 法测定上淸液的蛋白浓度。
从小量培养细胞中制备核抽提物
本方法适用于转染有质粒的细胞，这些质粒能表达编码转录因子的 cDNA。
a. 细胞用细胞淋洗缓冲液洗若干次。每个培养皿加入1ml 细胞淋洗缓冲液，用橡胶棒把细胞刮到缓冲液中。
b. 细胞悬液转移到 1.5 ml 离心管中，室温下用最大速度离心 2 min 沉淀细胞。
c. 对于原来在每个直径为 150 mm 的培养皿中培养的细胞，加 300ul 细胞重悬液重悬细胞，然后进行 3 次冻融。
d. 在 4°C 以最大速度离心 5 min 去掉细胞碎片。上清（即细胞裂解物）分装成小份贮存在-70°C。
2. 在 1.5 ml 离心管中加入：
核提取物或蛋白组分 1~23ul
32P 末端标记的 DNA 1~10fmol
1 mg/ml poly(dI-dC) 1ul
H2O 加到 25ul
可选择加入：
20%Ficoll 400 12ul
或
10% 聚乙烯醇 10ul
在 4°C 大约离心 5s, 使反应液都流到管底。冰浴 10~30 min。
3. 室温下加入 50ul MgCl2/CaCl2 溶液并轻轻混匀。室温下放置 1 min。加入 1~8 稀释的 DNA 酶 I 溶液，轻轻混匀并在室温下放置 1 min。
4. 加 75ul 终止液终止反应。很快地摇匀后，用相同体积的酚/氯仿抽提反应液。
5. 把液相转移到新离心管中，用 2.5 倍体积乙醇沉淀核酸。该乙醇溶液在-70°C 放置 15 min, 然后在 4°C 用最大速度离心 10 min 收集沉淀。用 1 ml 70% 乙醇洗沉淀，再次离心，然后在空气中干燥以去除残存的乙醇。
6. 加入 5~10ul 甲醛染液，剧烈振荡使 DNA 沉淀溶解。煮 3~5 min 使 DNA 溶液变性。
7. 准备 6% 或 8% 变性的聚丙烯酰胺测序胶，加样前进行至少 30 min 的预电泳。
8. 按以下次序加入 DNA 样品：
序列梯带
不含核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的对照 DNA
含有核提取物情况下用 DNA 酶 I 消化后的靶 DNA
含有核提取物但不含有 DNA 酶 I 情况下培养后的靶 DNA
9. 用足够的恒定功率跑胶，温度维持在 45~50°C。
使感兴趣的序列获得最佳分辨率的跑胶时间要根据经验确定。从甲醛凝胶上样缓冲液中染料的迁移率观察电泳的进程。
10.
电泳结束后，撬开玻璃板，把胶转移到一块厚的杂交纸上。真空干燥凝胶大约 1h, 然后用 X 射线胶片曝光，如果不用增感屏，需要在-20°C 曝光
12~16 h。此外, 干的凝胶也可以用磷屏图像分析（phosphorimage analysis), 大约 1~3 h。
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