DNA、RNA斑点杂交

实验概要

将RNA  或DNA 变性后直接点样于硝酸纤维素膜上，同探针进行杂交，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹。与Southern  及Nouthern  印迹法相比，其优点是简单、迅速，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，特别是对于核酸粗提样晶的检测。缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定的假阳性。

主要试剂

 southern、northern杂交试剂、RNA提取试剂

 DNA提取试剂

实验步骤

RNA点杂交

1）  纯化的RNA的点杂交和狭线杂交

安装印迹装置

1．切一张合适大小的带正电荷尼龙膜。用铅笔标上表示方向的记号。用水把膜简单弄湿，在20×SSC中室温泡1 h。

2．在膜浸泡期间，先用0.1 mol/L NaOH小心清洗印迹装置，再用无菌水洗干净。

3．把两片厚滤纸用20×SSC浸湿，再放到真空器顶部。

4．把样品槽插入装置的上部，把湿尼龙膜放在样品槽加样孔的底部，用吸管在膜的表面滚动以去除膜与装置夹层中的气泡。

5．加紧夹板，连接真空管。

6．加入10×SSC直至液面没过尼龙膜，关掉真空，再用10×SSC充满。

 RNA样品准备

1．把每个RNA样品（溶解在10μl水）分别与30μl RNA变性液混合。

2．65℃温育5 min，然后在冰上冷却。

3．向每个样品中加入等体积20×SSC。

4．轻轻向印迹装置中吸入10×SSC，直到淹没尼龙膜。

    RNA样品的印迹和RNA在膜上的固定

1．把所有样品轻轻加入狭线中，然后轻轻吸干膜。当所有样品都铺到膜上后，每个狭线用1 ml 10×SSC洗两次。

2．当第二次洗膜完成后，继续轻轻吸干膜。

3．取下膜，用紫外交联、烘烤或微波照射把RNA固定在膜上。

   固定化RNA的杂交与洗膜

1．把膜放入烤盘或杂交炉中，加入10~20 ml预杂交液68℃温育2 h。

2．把已变性的放射性标记的探针直接加到预杂交液中。在适当的温度下继续温育12～16 h。

3．杂交完后从塑料袋中取出膜，然后尽可能快地把膜转移到室温下装有100～200 ml、1×SSC（0.1% SDS）的塑料容器中。盖紧塑料容器，放到摇床上轻摇10 min。

4．把膜转移到另一个装有100～200 ml、预热到68℃的0.5×SSC（含0.1% SDS）的塑料袋中，然后在此温度下轻摇10 min。

5．按步骤17重复洗膜两次，使总的洗膜次数达到三次。

6．用滤纸吸干膜，在-70℃条件下放射自显影24～48 h（Kodak XAR-5 或相当的胶片）。钨酸盐型的增感屏比旧式稀土型的效果更好。当然，磷光成像仪也可以用来成像。

  2）RNA斑点印迹的制备（详见《分子医学技术》106页）

1．裁一张大小合适的滤膜，用软铅笔标记RNA加样的位置，一个cm的方格即可。

2．以20×SSC浸泡滤膜。

3．在65℃用以下溶液温育5min，使10～20μg的总RNA变性。

      置冰浴快速冷却5min，用微量离心管离心片刻以回收液滴，将管置于冰浴。

4．将滤膜铺在一叠经20×SSC浸泡过的滤纸（如Whatman 3MM）上。

5．在膜上点样，每孔4μl RNA，待一孔干燥后再加另一孔。

6．将滤膜置滤纸（3MM）上稍微晾干，用20×SSC漂洗片刻。

7．当滤膜仍潮湿时，将滤膜RNA面朝下在紫外线透照仪照射3～5min，使RNA固定于滤膜上，此滤膜已可用于杂交。

DNA点杂交

        DNA斑点印迹的制备

预备

1．冰浴中以70W左右的超声波处理基因组DNA 1min，用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，这些片段大小均应为7～10kb。

2．用TE缓冲液将DNA稀释至0.5μg/μl。

     斑点印迹的制备

1．加热5μg DNA（在10μl TE缓冲液中）至95℃ 10min，冰浴5min。用微量离心管短暂离心收集液滴，置冰浴。

2．裁一张大小合适的滤膜，用铅笔在滤膜上画25px的方格网以标记DNA点样的位置。

3．滤膜先用蒸馏水稍微浸湿，并用20×SSC使其饱和。将膜放在经20×SSC预饱和过的滤纸（Whatman 3MM）上。

4．以5μl的DNA分装样品在滤膜上点样，待前一个样品干燥后再点第二个样品。

5．将滤膜放在一张干燥的滤纸（Whatman 3MM）上稍微晾干，以5×SSC漂洗5min。

6．将DNA固定于膜上，硝酸纤维素膜需置80℃真空烤炉2h。当尼龙膜仍潮湿时，应用Saran包装膜（或任何类似的塑料薄膜）包裹，将DNA面朝下置紫外透射仪上，紫外线（280mn）照射3～5min，这时的滤膜已可用于杂交。

注意事项

1、点杂交要防止膜的污染。

2、其它同southern，northern。