ELISA双抗体夹心法

操作步骤

1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O•D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

1.　试剂

（1）　包被缓冲液（PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）:

　　　　　　Na2CO３ 1.59克

　　　　　　NaHCO３　 2.93克

　　　　　　加蒸馏水至1000ml

（2）　洗涤缓冲液（PH7.4 PBS）：0.15M

　　　　　　KH2PO4 　　　　　0.2克

　　　　　　Na2HPO４•12H2O　 2.9克

　　　　　　NaCl　　　　　　 8.0克

　　　　　　KCl　　　　　　　0.2克

　　　　　　Tween-20　0.05％ 0.5ml

　　　　　　加蒸馏水至1000ml

（3）　稀释液：

　　　　　　　牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

　　　　　　　加洗涤缓冲液至100ml

　　　　或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

（4）　终止液（2M　H２SO４）：

　　蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98％）21.7ml。

（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸棗柠檬酸）:

　　　　0.2M Na２HPO４（28.4克／L） 25.7ml

　　　　0.1M 柠檬酸（19.2克／L）　　　　　 24.3ml

　　　　加蒸馏水50ml。

　　　TMB（四甲基联苯胺）使用液:

　　　　TMB（10mg／5ml无水乙醇） 0.5ml

　　　　底物缓冲液（PH5.5）　　　 10ml

　　　　0.75％H２O２　　 　 32μl

（7）　ABTS使用液:

　　　　ABTS　　　　　　　　0.5mg

　　　　底物缓冲液（PH5.5）　 1ml

　　　　3％H２O２　 　 2μl

　　　抗原、抗体和酶标记抗体。

　　（9）　正常人血清和阳性对照血清。

2.器材:

（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。