ELISA实验结果为何有时候会复测？

酶联免疫吸附试验(ELISA)具有灵敏度高、特异性好、操作简便、技术可靠、试剂稳定等优点，广泛应用于传染性疾病、肿瘤标志物以及激素等项目的检测，但在ELISA实验过程中时常会出现复测现象即我们时常说的"花板"现象，即空白、阴性对照、阳性对照及室内质控结果正常，血液标本吸光度(OD)值普遍偏高（或个别OD值偏高，经复查均为阴性）、弱阳性结果较多，而大多数真阳性标本出现弱阳性结果。

这种现象影响检验结果的正确判读，对工作造成一定的不利影响，一旦出现“花板”，实验结果必须放弃，重新进行，不仅浪费物料和时间，而且还会出现样本量缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。同时也给广大献血浆的爱心人士在当日等候化验结果中加长等待时间，严重影响大家奉献爱心的积极性。为此我们对“花板”现象进行了原因分析与总结，使“花板”降至最低限度，从而提高检测的特异性，并得到更准确、更可靠的实验结果。影响因素分析如下：

一、标本因素

正确处理标本，防止大规模溶血、血浆层异物、使用一次性加样枪头，防止交叉污染。血清和血浆均可以用于检测，但血清的分离应在抽血后等血液完全凝固后再离心，以防止洗板因纤维蛋白堵塞洗板机，导致因洗板不充分引起“花板”。同时，溶血是由于红细胞破裂引起的，血细胞成分血红蛋白具有过氧化物酶特性，释放到血浆或血清中，会催化底物而造成假阳性。

二、试剂因素

正确保存及使用有效试剂。使用过期试剂及底物接触金属容器、底物混合后放置时间较长均影响实验结果的准确性。选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好，批间差小的试剂。不同厂家的试剂不能混用，包括底物和洗涤液。检测前应将试剂放置室温平衡半小时，洗涤液应现用现配，同时观察浓缩洗涤液中有无结晶，若有结晶应放37℃水浴中融化后才可使用。

三、技术人员操作因素 

严格按照相关实验SOP操作实验。加样量的准确与否，直接影响抗原抗体结合物的浓度，直至最后显色的深浅。加样时应尽可能的垂直加样，并加在包被孔的底部（注：勿应用力过度破坏底部包被物质），不可加在孔的上部及外部。实际工作中我们会发现，用加样枪加酶和底物时，速度过快，有时会加在两孔之间，所以操作时速度应适中，不可为了追求速度而不顾质量。具体情况因人而异。

四、温浴的因素

使用水浴箱作为温浴设备时，应注意水的深浅对结果的影响，当水浴箱中水的的实测温度37℃时，则水面温度可能只有34℃，空气温度更低，甚至只有二十多度，所以当水浴箱中水位过低时则酶标微孔板没有浸入水中，则反应温度会达不到37℃，相应的就会影响酶促反应。为防止边缘效应，酶标板应尽量浸入水中，以保证受热的均匀。水浴时，酶标板应封好，以免水滴滴入包被孔中，或阳性标本的蒸发。严格掌握温浴时间，不可为了早点出结果擅自缩短温浴时间。

五、洗板机的因素

洗板是ELISA实验中至关重要的一步，它决定着试验的成败。若血清中的纤维蛋白或洗涤液中有结晶，将堵塞洗板机针孔，造成全堵或半堵状态，以致使未结合的酶标记物不能完全洗脱，而使最后底物显色时加深，造成假阳性或“花板”。废液瓶装满后应及时清空，以防止废液回流对管道的污染，而使洗涤不彻底，造成“花板”。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道，以防止废液在管道中的残留。同时应根据仪器维护保养程序，定期对洗板机进行维护保养。

六、酶标仪

酶标仪应安置在避光条件下，比色前应提前15-30分钟开机预热，这样测定结果会更稳定。为防止显色的加深或减弱，显色时间完成后应立即滴加终止液（避免气泡产生），并在10分钟内完成比色。酶标板从水浴箱取出后应擦净孔底水滴，若有水滴或纸屑残留在孔底，会造成酶标仪读数错误，误判定为“花板”。

总之，ELISA试验看似是一项操作简单的诊断技术，但其中涉及诸多环节，若任意一环节操作不当，将影响结果的判断。即使在最佳条件下，不同厂家的试剂也会做出不同的结果，因此，对于ELISA试验的结果解释，我们只能说检测到某种抗体或抗原，而不能作为一种确诊试验。为了避免“花板”问题的出现，降低检测的假阳性率，获得更理想的实验结果，做出了以上总结及对策。