HPLC与UHPLC转换检测三聚氰胺

图1.  HPLC方法的谱图。

本文开发了HPLC和UHPLC方法用于食品中三聚氰胺的检测分析，两个方法都能提供极好的线性，并能方便地实现方法的转换。

2007年事件和近期三聚氰胺污染事件爆发后，大众迫切需要能够对食品中可能存在的三聚氰胺污染物定性定量的检测方法。最近的三聚氰胺检测方法包括LCMS和GCMS方法。GCMS方法要求对样品进行衍生化，而LCMS方法因使用梯度洗脱而要求色谱柱每次运行后清洗和再平衡。

格雷斯开发了可兼容于MS检测器的LC方法，使用的是既能用于HPLC系统也能用于UHPLC系统的HILIC填料平台。三聚氰胺既可以使用以5μm粒径HILIC填料填充的250x4.6mmID常规HPLC柱分析，也可以用1.5μm粒径HILIC填料填充的UHPLC柱使用UHPLC系统或快速HPLC 系统进行分析。

图2.  UHPLC方法的谱图。

两个方法都能提供极好的线性，使用的等梯度洗脱方法节约了柱再平衡时间而有利于快速分析。

HPLC方法

此方法实现了使用HILIC色谱柱和与MS检测器兼容的可电离流动相，满足FDA方法要求。低UV 检测显示在上样量40ng到100ug的范围内有极好的线性。

UHPLC方法

与常规HPLC方法相比，UHPLC方法可将分析速度提高4倍。使用1.5μm粒径的填料，最佳线性流速范围能随之扩展得到更宽的范围。因此，可以在更快的流速下运行样品而仍得到相当的柱效和分辨率。在上样量5ng到1000ng之间，此方法显示出极好的线性。

图3.  9针平行进样显示良好的重现性。

HPLC方法转换到UHPLC方法

近年来分析实验室对快速LC系统的采纳升级意味着在相当一段时期内实验室内将同时并存多种LC系统规格即常规HPLC，UHPLC和/或替代的快速LC系统。在系统之间进行方法的转移和优化并非是件简单的工作，但是，如果使用的是多种粒径规格<2μm, 3μm, 5μm和10μm的完全相同性质的填料，只要填料被填充于合适的柱硬件以适合不同系统性能，系统间方法的转移就变得简单易行：只要简单计算出同等线性流速就可以实现在系统间的方法转移、或是先在一个系统上开发优化方法然后转移到另一个完全不同类型的系统上。

SPE方法净化样品

从不同的食品基质中用固相萃取方法提取三聚氰胺以获得更准确的定量萃取。使用GracePureTM Cation-X，一种强阳离子交换树脂，能提供更干净、更浓缩的样品。

图4.   与常规HPLC方法相比，UHPLC方法可以提速4倍。

SPE柱规格

GracePureTM SPE Cation-X, 500mg/3ml（货号：5138770）

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样品制备

称取食品2g，与20ml1%三氯乙酸溶液和5ml乙腈混合，超声萃取30min后，离心15min，取上清液以0.45μm滤膜过滤，得到样品基质溶液。然后用三聚氰胺标准溶液加标，得到含量已知的SPE上样溶液。

图5.   ELSD检测器可用于三聚氰胺的检测。

SPE操作步骤

小柱初始化：2倍柱体积的甲醇，然后2倍柱体积的水；

上样：添加10ml加标样品液，使其缓慢流过小柱；

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清洗：3倍柱体积的水，然后2倍柱体积的甲醇；

洗脱：4ml甲醇：0.5M氨水（1 : 1体积比）。

HPLC分析条件

流动相：10mM醋酸铵：乙腈5:95（v/v）；HPLC柱：Alltima HP HILIC, 5μm, 4.6x250mm（货号：86466）；检测器：UV240nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样：10μl。

图6.  火腿肠、饼干、猪肉中三聚氰胺的萃取。

结论

本文开发了用于检测三聚氰胺的快速、等梯度的UHPLC和HPLC方法。对三聚氰胺的检测线性范围为40~4000ng。因为Grace VisionHT HILIC UHPLC柱和Alltima HP HILIC柱的填料性质相同，在HPLC柱上开发的方法可以轻易地转移到UHPLC柱上，反之亦然。与HPLC方法相比，UHPLC能提速4倍。这些方法中所使用的流动相可以与MS和ELSD检测器相兼容。