HPLC同时测定饲料中双乙酸钠／丙酸钙／山梨酸钾／苯甲酸钠

　　饲料添加剂是指在饲料生产加工、使用过程中添加的少量或微量物质,在饲料中用量很少但作用显著。防腐剂由于具有抑制和杀灭微生物增殖的作用而被广泛应用于食品工业中。目前我国批准在食品中使用的防腐剂有十几种,其中双乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾和苯丙酸钠在饲料中应用较普遍,其结构式见图1。双乙酸钠(sodium diacetate)是一种性质稳定的新型食品饲料防霉剂、酸味剂和改良剂,具有高效防霉、防腐、保鲜、增加营养价值等功效,应用安全性极高 ,现广泛应用于畜禽饲料。丙酸钙(calcium propionate)是我国允许使用的食品防腐剂及防霉剂,对霉菌、酵母菌及细菌等具有广泛的抗菌作用山梨酸钾(potassium sorbate)是一种国际卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂,它对食品风味无不良影响,能参与人体新陈代谢,生理安全性高. 苯甲酸是重要的酸型饲料防腐剂,虽然许多国家因其毒性较大,已禁止使用该类盐,但由于苯甲酸及其钠盐的价格便宜,在我国仍作为主要食用的防腐剂之一。

　　目前,双乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠、山梨酸钾的主要检测方法是气相色谱法 ,高效液相色谱法,毛细管电泳法以及离子色谱法等。现有的文献中同时检测双乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠、山梨酸钾4 种防腐剂的高效液相色谱方法尽管采用梯度洗脱,但分析时间仍较长(30 min)。本研究使用C18反相色谱柱,通过对缓冲盐的种类、浓度、pH 值等因素的考察研究,建立了一种简单快速测定饲料添加剂中的4 种防腐剂的等度洗脱高效液相色谱方法,尤其适用于饲料添加剂的质量监控。

　　1

　　实验部分

　　1.1

　　仪器与试剂

　　Waters 1525 型高效液相色谱仪,配有Waters2487 型紫外检测器；双光束紫外可见分光光度计,型号TU  -1901；pH/ Lon 510 酸度计,型号pH 5500,精度0. 01 个pH 单位；分析天平,型号AL  -204；超声波清洗仪,型号SK3300HP。

　　丙酸钙、山梨酸钾和苯甲酸钠标准品。双乙酸钠。磷酸二氢钾为分析纯。磷酸、甲醇均为色谱纯。实验用水均为超纯水。实验所用饲料添加剂样品来自当地饲料厂。

　　1.2

　　实验方法

　　1. 2.1

　　色谱条件

　　色谱柱:Hypersil ODS C18反相色谱柱(5 μm； 250 × 4. 6 mm)；流动相:0. 02 mol/ L磷酸二氢钾 -甲醇(65∶ 35, V / V)；流速:1. 0 mL/min；检测波长:214 nm；进样量:20 μL；柱温:25 ℃。

　　1.2.2

　　溶液的制备

　　标准溶液的配制:称取18. 7mg 双乙酸钠,39. 0 mg 丙酸钙,7. 0 mg 苯甲酸钠,9. 0 mg 山梨酸钾置于25 mL 容量瓶中,加约20 mL水,溶解,用磷酸调pH 值为2. 5,稀释至刻度,得到4 种标准物质的混合储备液。

　　供试品溶液:取0. 5g(精确至0. 1 mg)混合均匀后的样品至于50 mL 容量瓶,加入40 mL 水溶解,摇匀震荡,超声30 min,磷酸调pH 值为2. 5 后加水定容至50 mL,摇匀。所用样品分析前用0. 45 μm 滤膜过滤。

　　2

　　结果与讨论

　　2.1

　　色谱条件的选择

　　2.1.1

　　检测波长的确定

　　在190 ~ 400 nm 的波长范围内,对双乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠及山梨酸钾进行光谱扫描,所得的紫外谱图如图2 所示。从图2可知,4 种物质的最大吸收波长分别为:山梨酸钾252 nm,苯甲酸钠218 nm,双乙酸钠192 nm,丙酸钙194 nm。由于双乙酸钠和丙酸钙的最大吸收均在远紫外区,不宜检测,由国家标准(GB/ T23383—2009、GB/ T23383—2009)可知,食品中双乙酸钠、丙酸钙的检测波长均为214 nm。综合考虑双乙酸钠双、丙酸钙、山梨酸钠和苯甲酸钠均有较大的吸收波长,本研究选择吸收波长为214 nm。

　　2. 1. 2

　　缓冲盐种类的选择

　　使用甲醇为有机相,缓冲盐溶液分别为10% 0. 02 mol/ L 乙酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵。实验结果表明,磷酸二氢钾 -甲醇溶液可以很好地分离4 种物质,最终本实验选择磷酸二氢钾作为缓冲盐溶液。

　　2.1. 3

　　缓冲盐溶液pH 值的选择

　　使用甲醇为有机相,分别调节磷酸二氢钾缓冲盐溶液的pH 值为2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6.0、7. 0,考察其分离情况。结果显示,pH 值小于4. 0 时,双乙酸钠和山梨酸钠不能完全分离；pH 值增大到4. 5 时,苯甲酸钠和山梨酸钾双峰能够完全分离,双乙酸钠和丙酸钙两峰分离状况良好；当pH 值大于5. 0 后,双乙酸钠和丙酸钙不能完全分离。 因此选择缓冲溶液的pH值为4. 5。

　　2. 1. 4

　　流动相比例的选择

　　考察流动相中KH2PO4与甲醇比例为80∶ 20、75∶ 25、70∶ 30、65∶ 35、60∶ 40时,4 种物质的分离情况。结果表明,随着流动相中甲醇比例的增大,4 种物质的保留时间逐渐缩短,当甲醇比例达到35%时,四种物质的出峰时间最短而且能够完全分离,因此选择KH2PO4 ∶ 甲醇(V / V)为65∶ 35。

　　2. 1. 5

　　标准和样品pH 值的选择

　　当标准和样品处理后直接进样时,双乙酸钠裂分为2 个峰。当调节标准和样品pH 值为酸性时,发现当pH 值小于3时,双乙酸钠出峰正常,因此选择标准和样品最后使用磷酸调节pH 值为2.5。

　　综上所述,最佳分离条件为流动相:0. 02 mol/ L磷酸二氢钾(pH 值不调)  -甲醇(65∶ 35,V / V),标准和样品的pH 值为2. 5。

　　2. 2

　　方法验证

　　2. 2.1

　　线性关系

　　分别配制一系列不同浓度的双乙酸钠、丙酸钙、山梨酸钾和苯丙酸钠混合标准溶液,在最佳色谱条件下测定,以峰面积A 对浓度c 作图,绘制标准曲线,得到4 种物质的线性范围和回归方程,如表1 所示。

　　2. 2.2

　　检出限与定量限

　　取4 种检测物对照品标准溶液稀释到合适浓度,以最佳色谱条件进样,以信噪比的3 倍和10 倍计算检出限和定量限。结果测定如表1。现有的文献同时检测食品中双乙酸钠、丙酸、苯甲酸、山梨酸4 种防腐剂的高效液相色谱方法,其检出限分别为1.7,1. 0,0. 44,0.45 mg/ mL,均高于本研究所得的检出限。

　　2.2. 3

　　精密度

　　对饲料添加剂样品进行处理后,日内和日间连续进样5 次,计算日内精密度和日间精密度,测定结果如表2 所示。

　　2. 3

　　样品测定

　　在最优的实验条件下,对4 个已知的不同批次的饲料添加剂样品按照实验方法进行处理后进行测定,将检测结果转化为质量百分含量,检测结果如表3 所示。其标准和样品谱图如图3 所示。

　　2. 4

　　回收率

　　选择一个批次(批号:281305001)的样品,加入已知3 个浓度水平的标准溶液,按照样品处理步骤处理样品后进样,结果如表4 所示。从表4 中看出,双乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠和山梨酸钾的平均回收率分别为91.8%、87. 5%、92.3% 和83.4%。说明本方法测定饲料添加剂中的4 种添加剂回收率良好。

　　3

　　结

　　论

　　本研究建立了一种高效快速的HPLC 方法,可同时测定饲料添加剂中的双乙酸钠、丙酸钙、苯甲酸钠和山梨酸钾,4 种物质在11 min 内能够完全分离。该方法样品处理简单,分离效率较高,灵敏度高,是进行饲料添加剂检测的一种有效方法。