HPLC故障排除：保留时间问题（一）

发布时间：2020-04-13 15:06 原文链接： HPLC故障排除：保留时间问题（一）

可能致因

	预防措施/解决方案
减少保留时间
键合固定相的损失（流失）	更换柱（更换色谱柱）在pH值为2-8的硅基（硅胶基质）RP柱上操作
固定相上的（存在）活性基团	在流动相中使用有机改性剂增加缓冲强度（增加缓冲液离子强度）
增加流量（流速）	检查并调整泵的流量（流速）
柱超载（色谱柱过载）	减少注入的样本量（减小进样量）使用具有更大内径的柱（色谱柱）
延长保留时间
改变流动相的成分	覆盖溶剂容器（盖紧溶剂瓶）制备新的流动相
键合固定相的损失（流失）	更换柱（更换色谱柱）
减少流量（流速）	检查并调整泵的流量（流速）检查系统是否存在泄漏，包括泵的密封（泵密封圈）
流动相中存在气泡	检查流量和压力对流动相脱气（流动相脱气）
波动保留时间
柱平衡（色谱柱平衡时间）不足	在运行之间（在两次进样之间用更长时间）充分平衡柱用浓缩样品调整色谱柱
流动相成分的变化	检查流动相的成分，必要时补充新的成分（新配流动相）检查比例阀的准确度
缓冲能力不足	使用> 20mM的缓冲液浓度
波动柱的温度（柱温波动）	稳定的（稳定）室温保持柱恒温

2. 保留变量（时间变动）

如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其致因很可能是如下因素发生了变化：流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速。

如果等度或梯度流动相在在线式混合中出现错误，也可能导致保留时间出现问题。

下面将简要介绍这些问题来源（对上述每个原因都简述如下）。

2.1.如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。

在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。
当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留（选择性因子，a）通常会发生变化。

检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。

方法文件应包含特定流动相变化影响的相关信息。例如，有机溶剂或pH值的微小变化会对色谱图产生特征（在色谱图体现出特征性的）影响，如分辨率或保留的变化（分离度的变化或保留时间的漂移）。

如果您怀疑设备出现故障，请将色谱柱和流动相移至另一个HPLC系统，然后再次运行。

如果问题依然存在，则问题在于流动相或色谱柱；如果问题不再出现，则可能与其他系统组件或参数相关。

2.2.色谱柱化学（化学性质）变化会在色谱柱的整个生命周期内出现，并且一般会在数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。

更换新柱以确定是否是柱老化导致的问题（可确证色谱柱老化）。

500-2000次注射（进样）的柱寿命是较为理想的；在这一点上，柱成本相较于整体分析，是十分微小的，所以更换新柱的可行性较高（色谱柱在整个分析的成本中所占比例低，因而可以合理更换色谱柱）。

如果色谱柱的使用寿命过短，应仔细检查操作条件，以确保它们适用于该色谱柱。

图5显示了在极端操作条件下，色谱柱寿命较短的示例（缩短的寿命）