HPLC故障排除：保留时间问题（三）

图9的示例显示了在约25％、50％和75％B的线性（箭头）条件下，空白梯度运行呈现有规律的偏移。

图8. 图9显示了HPLC系统的梯度阶梯测试结果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯级；（b）以1％的梯级向上跟踪至45-55％。箭头显示了50和51％之间的“较短”梯级。来源[4]。

与这些条件相对应的阶梯测试如图8a所示，并且在这个度量（放大比例）下表现良好。

为了更仔细地检查问题区域，在45-55％B范围内以1％的增量进行阶梯测试，如图8b所示。

这个扩展（放大）图清楚地显示了在50％和51％之间的梯级中，存在不规则性。

在线性图中的定期（有规律间隔的）误差（图9）表明，控制比例阀的算法或比例阀本身存在问题。

在目前的情况下，调整控制（控制软件）软件无法解决问题，因此应更换比例阀，以解决问题（因此更换了比例阀，问题被解决）。

图9. 故障比例阀线性梯度图。箭头显示线性偏离；绘制下面的虚线以供参考（虚线为标准参考线）。以1mL/min的速度运行梯度0-100％B 15分钟；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；检测UV 265nm。来源[4]。

尽管可以假设单一来源是导致特定HPLC问题的原因（虽然通常可以假定某HPLC问题只有一个故障原因），但情况并非总是如此。

图10a显示了以非常浅的梯度（30分钟内19-24％ACN）连续三次注射肽样品的结果（显示了一种多肽样品三次连续进样，窄梯度洗脱（30分钟内19-24%乙腈梯度洗脱））。

由于怀疑存在流量（流速）问题，因此在双活塞双泵系统中更换了所有8个止回阀（单向阀）和4个泵密封件（圈）。

这大大改善了保留变量（保留时间大为改善），保留范围从2.1分钟变化到1.0分钟（图10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。

为了进一步研究问题，将溶剂预混合到装有15% ACN的A容器和装有25％ACN的B容器中（在A瓶中预混合15% 乙腈，在B瓶中预混合25% 乙腈）。

当调整仪器设置以产生与图10a和b相同的梯度时，获得图10c所示的结果。尽管仪器的配比精度在±0.1％的规格范围内，但对于非常浅（窄）的梯度来说仍是不够的。

预混合溶剂将有效精度从0.1％提高至0.01％，如果该样品希望具有令人满意的保留时间再现性，这点是必需的。
预混合可以提高系统性能，以满足苛刻的分离要求。

图10.三次连续注射肽样品的扩充（放大）色谱图。产生的色谱图：（a）使用原始系统配置（b）更换所有止回阀（单向阀）和泵密封件（圈）后（c）使用预混流动相。色谱柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃运行，并在215nm检测。梯度：30分钟内19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。来源[5]。