HPLC法对猪体内金霉素的残留检测

　【摘要】  目的  了解饲喂金霉素后药物在猪体内的残留情况。方法  应用高效液相色谱仪测定猪部分组织中金霉素的含量，根据残留量，确定临床应用金霉素的休药期。结果  HPLC法稳定性好，测量精度高，最高回收率达87.8%，最低回收率达53.6%。结论  连续5天以600ppm剂量饲喂猪的安全休药期为27天。

　　【关键词】  金霉素；高效液相色谱；猪；残留

　　HPLC detection of residual in swine afcer fed chrysomycin

　　CHEN Zhi-bao，WANG Wei-na，HUANG Da-peng，et al.Life College of 81 Farming University，Heilongjang 163319，China

　　【Abstract】  Objective  This study was to get the message of the residual in swine after they were fed chrysomycin. Methods  The HPLC was used to determine the content of chrysomycin in part organism of swine，based on the residue level to definite the drug holiday of clinical application of chrysomycin. Results  HPLC had good constancy and high measurement precision. The highest recovery rate could reach 87.8%，and the lowest recovery rate could reach 53.6%.Conclusion  Using of 600 ppm dosage to feed the swine in successive 5 days，the safe drug rest was 27 days.

　　【Key words】  chrysomycin; HPLC; swine; residual

　　四环素类(TCS)药物是一类广谱抗生素。随着畜牧业的发展，其作为饲料添加剂被广泛应用［1］。但在畜牧生产上由于不合理应用(用量过大或时间过长)，导致动物组织中(如肌肉、肝、肾等)四环素类药物的残留量过大，影响我国的出口贸易，以及食用这些含有残留的动物性食品后会给人体健康带来某些影响［2］。

　　本试验是研究用高效液相色谱法［3］来检测猪组织中金霉素药物的残留量。根据残留量，确定临床应用金霉素的休药期，为合理应用金霉素提供理论依据。实验结果如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物  金霉素，河南驻马店华中正大有限公司，15%的金霉素，批号0407155，商品名：喜特肥。

　　1.2  实验动物  90～110kg育肥猪。

　　1.3  猪的饲养、用药及样品采集：分别给40头猪，饲喂添加600PPM金霉素饲料［4］，连喂5天。分别于用药后第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33天，每次屠宰2头猪，采集每头猪的臀部肌肉、肝脏、肾脏组织样品（臀部肌肉100g，肝脏50g，肾脏50g），将所采样品的日期和名称进行标记并于-20℃冷冻保藏，待测。

　　1.4  仪器  高效液相色谱(HPLC)仪：SIB810型泵、SP8450型UV检测器；反相C-18柱；微量进样器(25μl)  (美国光谱物理公司)；YQ-3型电动匀浆机(江苏江阴科研器械厂)；LD4-2A离心机：4500r／min(北京医用离心机厂)；旋涡混合器：WH361型(江苏太仓鹿河生化仪器厂)。

　　1.5  试剂  所用甲醇为重蒸过滤甲醇；水为重蒸馏水。乙腈 (色谱纯);甲醇，乙酸铵，柠檬酸，依地酸二钠 (分析纯);磷酸氢二钠，磷酸氢二铵，草酸铵(分析纯);草酸(分析纯);三氟乙酸 (进口) ( Art．808260);N，N�二甲基甲酰胺(分析纯);盐酸金霉素标准品(进口) (纯度84％) (SIGMA公司);盐酸土霉素标准品(进口) (900μg／mg ) (SIGMA公司)。

　　1.6  流动相  甲醇/乙腈/0.01 mol／L草酸(1.5/1.5/2.0 pH=2.0)。

　　1.7  样品的提取与测定  用pH=4.0的MCI／Vaine／Na2EDTA缓冲液将金霉素药物从样品中提取，过滤后通过C-18微柱水洗后，用草酸甲醇将药物洗脱，洗脱液用高效液相色谱仪进行测定。

　　1.8  HPLC测定工作条件  流速：1.8ml／min。柱温：室温。检测波长：350nm。AUFS：0.002。衰减AT=4。进样量：10μl。纸速：CS=0.25cm／min。

　　2  结果与分析

　　2.1  标准曲线测定结果  金霉素标准曲线：测定结果见表1，根据表中数据求得其回归方程为：金霉素(mg／kg)=平均峰面积*0.7482+0.0380，相关系数=0.9979。表1  金霉素标准曲线测定结果

　　2.2  回收率的测定结果  添加一定量的相应标准液于猪肉匀浆组织中，提取后进行测定，流动相与流速同标准曲线测定。金霉素在肉猪组织中的回收率最低为53.6％，最高达87.8％。

　　2.3  猪不同组织、不同给药时间金霉素含量的测定结果  猪不同组织、不同给药时间金霉素含量的测定结果见表2，由表2可知，应用金霉素后，猪组织中金霉素残留量基本呈线性关系，符合药物代谢规律。表2  猪不同组织、不同给药时间金霉素含量的测定结果

　　3  讨论

　　3.1  色谱条件的选择  改用流动相：甲醇／乙腈／0.01 mol／L草酸(pH=2.0  1.0：1.5：2.5)对标准液TC进行测定，结果较理想，能绘制了TC的标准曲线，由于资料报道［5，6］的流动相：甲醇／乙腈／0.01mol/L草酸比例为1.0：1.5：2.5，据本实验仪器实际情况，把流速2.0ml/min改为1.5ml/min或1.8ml/min，这样出峰时间晚，在与其实验标准峰形比较时，不宜确定所出的峰是否为金霉素的峰。因此改变流动相的比例为：甲醇/乙腈/0.01 mol/L草酸(1.5：1.5：2.0)，并在以后的标准曲线制作中一直采用此流动相及其比例。

　　3.2  回收率的测定

　　3.2.1  提取过程中，洗脱液的选择：提取过程中，用6.0ml甲醇草酸(0.01 mol/L)进行洗脱，曾用混合样品做试验，用0.2mol/L柠檬酸钠混入洗脱液中(0.2mol/L柠檬酸钠占1/5～1/100作洗脱液)，回收率有所提高，但混合样品分离不好。选用本实验所用的0.01mol/L草酸甲醇的效果较好，可见洗脱液的选择还可进一步研究。

　　3.2.2  提取过程中，许多操作需不断摸索。从提取液MCI／Vaine／Na2EDTA的体积、离心的转速、离心时间到抽滤泵的压力乃至洗脱的流速和时间等［7，8］，在操作过程中各种因素不同都可能造成回收率的偏低。因此，提高金霉素药物残留回收率和检测限，需认真操作每一步骤。

　　3.3  金霉素为常用抗菌、促生长饲料添加剂，应用范围很广。肉品中过高的金霉素残留，对人的健康十分有害，各个国家和地区都对金霉素残留制订一定的标准。根据“欧盟”及“供港食品”标准的规定，金霉素在猪肌肉、肝脏、肾脏组织的残留量分别为0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg。表3中，在用药后25天，肌肉和肝脏组织的残留已达到此下限，而肾脏23天时就达到标准，考虑到检测过程中的回收率问题，金霉素的准确休药期定为27天更为合理。