高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用(HPLC―ICP―MS)技术应用于人工养殖富硒海带中硒的研究

　　实验前的准备和实验测定 
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　　实验器材和试剂准确。（1）实验仪器与试剂： 1100型液相色谱仪、7500型电感式耦合等离子体质谱仪以及通过PEEK管连接高效色谱柱和ICP-MS雾化器等，色谱自动进样器。一级水（Milli-Q水，电阻率为18.25MΩ）用来作为全部的标准溶液和样品制备用水，色谱纯硝酸、色谱纯甲醇、分析纯Tris以及过氧化氢，分析纯主要包括盐酸、柠檬酸、乙醇铵、氢氧化钠以及己烷磺酸钠等物质。 
　　（2）标准物质：硒标准品有高纯度甲基硒代半胱氨酸、高纯度硒代蛋氨酸以及分析纯亚硒酸钠。配置得到1mg/L的硒混合标准储备溶液，将其保存以便后期进行实验的过程中使用，混合储备溶保存在冷藏4℃的温度下。生物标准物质，茶叶。 
　　（3）标准溶液：混合元素标准溶液的准备，需要Fe，K，Mg，Na，Ca等溶液分别1000g/L以及Ag，Tl，Co，As，Cd，Mn，Cr，V，Al，Pb，Ni，Zn，Cu等溶液分别100mg/L。以为1%的HNO3进行稀释，得到100mg/L和20μg/L的STD1和 STD2。另外一种溶液，Hg标准溶液的配备，利用2%的HNO3为介质，分别配置1μg/L和2μg/L的Hg，分别记作STD3和STD4。调谐溶液采用Li，Tl，Ce，Y，Co等浓度分别为10μg/L的混合溶液。另外，采用In，Tb，Ge，Sc，Bi，Y和Li浓度分别为10mg/L的混合溶液稀释得到1mg/L内标溶液。 
　　（4）最后准备富硒前后海带的两组样品，进行研究实验。 
　　样品准备。在选择富硒海带时，需要针对海带的质量进行筛选，选择质量比较好，生长环境较好的海带，选择的海带需要保障质量，保障一定时间内运回实验室，并且将其放置于海水中，以保持其质量和其中含有的成分，放置的方式足以好选择挂绳法，在其中添加一定量的Na2SeO3，硒的浓度保障在10mg/L，添加一定浓度的氮磷营养盐，氮的浓度要保持在300μg/L，磷的浓度保持在30μg/L。同时保持一定的光照强度，水中的盐度需要在4%，温度在恒温2℃，用氧气泵向水中充氧，每两天换一次水，一共在实验室水中养殖10天。同时做一组空白对照，不添加硒，其他条件一样。最后用一级水将海带洗干净，在85℃的温度下将其烘干，冷却，样品经过粉碎均匀后，干燥保存。 
　　样品硒形态的测定准备。本次试验采用蛋白酶，0.1mol/L HCl，20mmol/L乙酸铵这三种提取液，分别称取上述样品1g，各加入提取液20mL，摇匀，超声提取30min，转速9000r/min离心2min，取上层澄清液体过膜，0.45μm，于2mL进样瓶待用。 
　　样品的总硒测定准备。样品利用微波消解法消化，分别取两组处理好的海带干粉样品三份样品，每份0.5g，将样品放置在消解罐中，各加8mL硝酸，加盖，放入微波消解仪消解，温度升温程序为120-150-180℃，功率为1600w，消解后赶酸至2～4mL酸液，再进行放置冷却后，向容器中加入1mL的H2O2，用一级水多次冲洗消解罐转移样品，将其定容在25mL，然后测定硒的总含量，同时进行空白对照，不称取样品。利用茶叶参考标准物质做质控，与此同时，对77Se，78 Se，82Se三种物质的硒同位素进行测定。 
　　研究实验结果与分析 
　　海带胁迫硒培养前后其中各种元素含量的变化和硒含量的变化情况。根据上述的STD3和STD4、混标STD1和STD2为准，做标准曲线，用Li、Bi、Tb、In、Se、Ge、Y各1μg/L的混合溶液作为内标进行测定，测出结果每种元素具有良好的相关线性，标准值测定的结果和参考物质茶叶的各元素测定结果基本一致，证明实验的结果具有一定的可靠性。海带（以干基计）空白对照组含硒量为0.281μg/g，经过人工富集培养的海带硒的浓度达到900μg/g。海带中的其他元素能够在硒的富集作用下产生协同效应，并且其中集中元素的浓度会有一定程度的增加。 
　　三种硒形态的色谱系统分离情况比较分析。 
　　在上图中，A采用第一种色谱系统（C8色谱柱，流动相为柠檬酸和甲醇，流速0.5mL/min）下，第一出峰是亚硒酸钠，其次是甲基硒代胱氨酸，最后一是硒代蛋氨酸。B第二种色谱系统（C8色谱柱，流动相为水-甲醇，流速1.0mL/min）下，其中分离度比较大的是硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸。最后一种C色谱系统（C18色谱柱，流动相为乙酸铵-甲醇，流速1.0mL/min）下，三个峰能够在较短时间内出峰完全，同时峰信号强度较强并且峰的形态比价尖锐。以上，第三种系统的效果较优。 
　　RP-HPLC-ICPMS分离法进行海带样品硒形态的测定。硒状态的研究与分析在一定程度上受到提取溶液的影响，利用超声提取的方式处理样品，这样能够在一定程度上提高效率，以下是按照图1中的第三种色谱系统进行分离，图2的ABC分别为用HCL，的乙酸铵溶液以及蛋白酶提取溶液萃取硒形态的出峰图，进行分离比较。以HCL萃取亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和硒甲基半胱氨酸，效果最佳。 
　　根据上述图1和图2可以得知，在利用离子对试剂进行反相液相色谱分离实验中，提高样品分离的效率不需要柱前衍生化，其中采用上述提取液与流动相结合C18柱的色谱系统进行提取分离，分离效果比较理想，同时保留的时间比较长，峰形也尖锐不拖尾。 
　　进行人工有目的性的养殖海带使其富硒，在提高总硒的同时，本实验也证明有机硒含量也有所提高，而有机硒具有很高的保健价值与防癌作用，结合我国国情，是我国的保健食品行业发展不可或缺的重要部分。其中本次用到的高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用技术在用于人工养殖富硒海带中研究总硒及硒形态中起到关键作用，利用这项技术能够保障实验结果的准确性，同时能够保障实验能高效率完成，在一定程度上降低时间成本。因此，需要加强对这项试验技术的研究与运用，为未来海带硒形态研究实验打下坚实的基础。