HPLCICPMS测定硒蛋白中硒代氨基酸的方法

　　1 引言 
　　硒是一种人体必需的微量元素，以硒酶、 硒蛋白的形式广泛存在于生物体内，其中含有硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸残基的蛋白质为硒蛋白[1]。硒半胱氨酸是承载硒元素最主要的方式，硒半胱氨酸也因其重要性被称作第21个氨基酸，在哺乳动物体内参与蛋白组成，所以这种情况下硒蛋白也就是含有硒半胱氨酸的蛋白。此外，硒以硒甲硫氨酸或硒蛋氨酸为主要结合态存在于粮食中。虽然硒甲硫氨酸参入蛋白质合成可能是随机过程，但是含有硒甲硫氨酸的蛋白也称为硒蛋白。越来越多的证据显示植物硒蛋白中含有硒蛋氨酸和硒代半胱氨酸[2]。最近，王卫真等[3，4]从大蒜中初步分离出硒蛋白，纸色谱证实蛋白中含有硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。 
　　国外已有数篇文章综述了硒形态分析的相关方法[5，6]，联用技术被认为是进行化学形态分析（chemical speciation）的有效手段，其中高效液相色谱（HPLC）与电感耦合等离子质谱（ICP/MS）联用作为一种高灵敏的元素形态分析方法得到广泛的应用[7～10]。本研究建立了分离和分析硒蛋白的HPLC-ICP/MS联用的方法，并成功地应用于不同类型实际样品硒蛋白中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的研究。 
　　由于硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为敏感氨基酸，其中半胱氨酸残基的侧链琉基不稳定；蛋氨酸的含量往往较低，且用HCL水解时特别是有碳氢化合物存在时很容易遭到破坏，所以测定不能用普通的水解方法进行[11]。本研究采用中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，本类酶能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP。 
　　离子交换色谱包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱，不仅可以分离无机离子，而且可以分离任何易解离的物质[12]。阴离子和阳离子交换色谱都成功的应用于分析生物样品中的硒形态[13，14]。Bird等比较了离子交换色谱、反相色谱、反相离子对色谱三种不同分离方法分离富硒化合物的优缺点[14]。 即使阴离子交换色谱分离能力应用不是很广，但是它可以分离四六价硒，而这点反相色谱和反相离子对色谱是做不到的[15]。 
　　2 实验部分 
　　2.1 材料 
　　2.1.1 仪器与耗材 
　　Varian820-MS等离子体质谱仪（美国Varian公司）；Agilent- 1200非金属流路泵；色谱柱为Hamilton PRP-Xl00（250 mm×4 mm）分析柱和预柱（美国安捷伦科技有限公司）；水浴恒温震荡器SHZ88A（常州诺基仪器有限公司）；通用型高速冷冻离心机Z383K（德国Hermle）；离心超滤管3KDa（美国Amicon Ultra）。 
　　2.1.2试剂 
　　亚硒酸钠（Se4+）、硒酸钠（Se6+）为高纯试剂（美国 Inorganic Ventures）硒蛋白硒代半胱氨酸（SeCys）、硒代蛋氨酸（SeMet）为高纯试剂（J&K Scientific）； 胰蛋白酶；蛋白酶K（德国Calbiochem）；链霉蛋白酶（德国Sarva）；蛋白酶（XIV） （德国Sigma）；超纯水由Thermo Fisher Barnstead 实验室水纯化系统（美国Thermo Scientific）制备。 　　3 讨论： 
　　由于硒形态的不稳定性，样品的提取过程尽量保持硒形态的原始特性不变， 比仅仅检测硒元素复杂得多，也是植物硒形态分析准确性的关键[17]。在小分子硒形态方面，主要包括水提取法、酸提取法和酶提取法[18]。水提取对一些非结合蛋白形式的硒形态较适合，如硒-甲基硒代半胱氨酸、γ-谷酰基-硒甲基硒代半胱氨酸， 但对以蛋白形式结合的硒， 回收率较差；酸提取法有很高的回收率， 但酸易使硒形态发生转变； 酶提取法的应用最广，常用的酶有蛋白酶K，蛋白酶 XIV，胰蛋白酶，胃蛋白酶和链霉蛋白酶等。酶提取法通常在温和的条件下（37℃， pH 7.0）进行，可以减少硒形态之间相互转化，但此法提取的时间较长， 一般需 24～48 h。为保证解离完全，酶活性对样品的适用性与通用性，最后选定运用蛋白酶K、链蛋白酶、胰蛋白酶来进行酶解（见图1）。 
　　由于SeCys2、SeCys、SeMet 等硒的化合物随着p H 值的改变化合物形态可呈现中性、带正电或带负电，可见离子交换色谱分离模式比较适合硒蛋白形态的分离，离子交换色谱是形态分析，蛋白质组学中使用最为广泛的色谱技术之一[19，20]，具有柱容量高，分辨率高，条件温和，分离后样品可被浓缩等优点；反相离子对色谱操作简便、柱效高，广泛用于极性的元素形态分离中。对硒代氨基酸有良好的分离效果，在本研究中较易控制且有明显效果的是流动相的性质。因此考虑到流动相对样品的缓冲能力所以本研究决定使用5mM的柠檬酸铵加2%的甲醇（pH4.9）作为流动相。 
　　较氢化物一原子吸收光谱法、荧光分光光度法、原子吸收光谱法等方法这种检测方法能够更精准的对硒蛋白中硒代氨基酸进行检测，根据酶解产物在HPLC-ICP-MS色谱图中各峰的保留时间来实现硒蛋白的定量检测，该方法的建立无疑是对食品成分分析和食品的开发利用具有重要意义。