IHC全攻略2：如何制备样品

　　对于每一项IHC/ICC研究，组织和细胞样本的制备都不可掉以轻心。为了方便孵育，整个组织必须被切成超薄(5-10 μm)的切片，或切成小块用于整体免疫组化(whole mount IHC)。对于ICC实验，在开始染色步骤之前，细胞必须附着在显微镜载玻片或盖玻片上。样本制备也与固定方法密切相关，而固定方法又会受到检测技术(荧光 vs 显色)的影响。

　　在大部分情况下，某个实验变量将决定样本制备的最合适方法。例如，浸润固定在甲醛中的组织必须石蜡包埋，并利用切片机切片。或者，为了检测磷酸化依赖的表位，组织可能需要快速冷冻，因此在醇类固定之后就需要一个低温箱来进行样本切片。

　　石蜡包埋的组织

　　石蜡包埋为长期保存组织样本提供了最佳选择。组织在用石蜡包埋之前必须固定。固定可通过灌注或解剖后立即浸润来实现，一般需要4-24小时。不建议固定组织24小时以上，因为固定过度可能导致抗原的遮蔽。如有必要，组织在固定后可转移至酒精中，直至包埋过程。

　　因为石蜡与水是不混溶的，所以组织在加入熔化的固体石蜡前必须脱水。脱水是通过浸润在浓度递增的酒精中而实现的。这种方法逐步改变疏水性，让细胞伤害最小化。脱水之后，组织与二甲苯共同孵育，以去除任何残留的酒精。石蜡一般加热到60˚C进行包埋，随后过夜硬化。之后利用切片机用锋利的刀片将组织切成超薄的切片。切片在显微镜载玻片上干燥，并长时间室温储存。组织切片在开始IHC/ICC步骤之前必须再水化。石蜡是组织包埋的最便宜也是最常用的物质。不过，组织也可包埋在塑料中，凝固得更硬，并切成更薄的组织切片(1.5μm vs 5 μm)。

　　冰冻组织

　　冰冻组织样本的好处之一是省去了石蜡包埋组织最初所需的固定步骤。在检测翻译后修饰如磷酸化时，快速冷冻特别有益。冰冻组织的制备可将组织浸润在液氮或异戊烷中，或埋在干冰里。对于冰冻组织，在冷冻和切片之后进行一个短时间的固定。冰冻组织切片最常用醇类固定，这避免了修复甲醛交联所遮蔽的表位的需要。冰冻组织在低温箱中切片，切片在-80˚C可储存多达1年。

　　冰冻组织切片的处理时间比石蜡包埋切片要短一些。不过，冷冻对于组织的长期保存是不够的，且细胞内冰晶的形成可能会负面影响亚细胞的细节。此外，冰冻切片通常比石蜡切片厚。这可能导致较低的显微镜分辨率以及差的组织形态学图像。因为冰冻切片通常保留酶的活性，所以封闭可能影响IHC检测的内源酶的活性也是特别重要的。

　　IHC样本制备的比较

　　细胞样本

　　在开展ICC研究时，首先必须将细胞附着在固体支持物上，如显微镜载玻片或盖玻片。这对于贴壁细胞很简单，它们可直接放置在6孔或24孔板底部的高级无菌盖玻片上生长。将盖玻片预包被一层带电荷的聚合物(如多聚赖氨酸)和/或细胞外基质蛋白(如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白或胶原)，可增强细胞附着。染色过程的所有步骤可在微孔板内的盖玻片上开展，向每个孔中加入适当的溶液并移走溶液。悬浮细胞可通过Cytospin® 离心或与包被多聚赖氨酸的玻片孵育10分钟而附着在玻片上。