Illumina助力云南省CDC快速破译新型冠状病毒全基因组序列

　　据云南广播电视台《都市条形码》微信公众号报道，1月21日，国家卫生健康委确认昆明市首例输入性新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例。云南省疾控中心急性传染病防制所所长伏晓庆介绍，1月17日中午12点，实验室收到患者采样标本，下午3点就完成了核酸检测，结果呈阳性。

　　1月18日凌晨1点，实验室开始病毒全基因组序列测定，20日上午10点测序工作完成，经过与国家公布的新型冠状病毒全基因组序列进行比对分析，证明测序结果与公布的序列高度同源，确证云南发现病例为新型冠状病毒感染的肺炎确诊病例。伏所长还表示，全基因组测序技术对于疫情研判、防控方案制定与措施采取，有至关重要的作用。

图1：云南CDC技术专家正在进行病毒MiSeq测序前的准备（图片来源：云南省CDC提供）

图2：云南CDC技术专家正在生物安全柜中进行测序文库样品的前处理（图片来源：云南省CDC提供）

图3：利用Illumina平台测定的、且在GenBank上公布的新冠病毒全基因组完整序列。（图片来源：GenBank官方网站）

　　散弹枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomics），即对待检样本的直接测序，专用于微生物群落的种属鉴定及丰度测量。在传染病领域，这一方法特别对新现病毒具有强大的检出能力，规避了常规病毒分离培养过程可能引入的病毒变异，同时最大限度压缩了病原检出的时间。病毒是“一包基因”，基因组结构功能变异度高，没有类似于细菌16S rRNA序列的分子标志物可供统一的进化亲缘分析。

Jasper F. W. Chan et al. Clin. Microbiol. Rev. 2015； doi:10.1128/CMR.00102-14

图4：冠状病毒科进化亲缘关系

　　对于检测诸如埃博拉、SARS冠状病毒、MERS冠状病毒，狂犬病毒等形形色色潜伏于环境或天然宿主中的RNA病毒而言，病毒本身滴度和背景核酸干扰是检测成功与否的关键之一。核酸富集（Enrichment）与 病毒基因组互补DNA合成两个技术环节显得尤为重要。已发展出各式技术、方法用于提高核酸产量。

　　动物疫源性宿主（Zoonotic reservoirs）在传播病原的过程中扮演着重要的角色。利用高通量测序能对动物宿主体内潜伏的病原进行广谱筛查，已成为实现关口前移与治未病先进防疫理念倚仗的关键技术和重要手段。

　　以蝙蝠为例，所携带的病毒种群（组）存在天然的蓄存与流行。不同种类蝙蝠的病毒组有很大差异，其中就包含对脊椎动物具有致病性的病毒种属，特别是高致病新现病毒，如甲型流感病毒、汉坦病毒、丙肝病毒、SARS样beta群冠状病毒、乳头瘤病毒、细小RNA病毒等。

　　虽然本次武汉新冠病毒的来源、传播途径问题仍不清楚，但蝙蝠携带SARS样冠状病毒的发现早有报道，He等对268只蝙蝠肛拭子进行宏基因组测序，成功鉴定发现alpha、beta群冠病。其中于云南宝山检出的SARS样的冠状病毒（LYRa11）基因组全序列显示，它与人类SARS冠病序列一致率高达91%；尤其是刺突蛋白 人类细胞受体结合域（Receptor Binding domain，RBD）编码序列与人SARS冠病高度近似，且能与SARS病人恢复期血清发生免疫反应，提示了两者可能的重组亲源关系。此外，我国科学家还从蝙蝠体内检出MERS冠状病毒的近亲。