IntabioZT系统助力蛋白药物电荷变异体快速高效鉴定

发布时间：2024-08-02 00:00 原文链接： IntabioZT系统助力蛋白药物电荷变异体快速高效鉴定

在蛋白药物的生产、存储以及使用过程中，往往会发生产品的聚集、降解以及各种翻译后修饰，导致其等电点及表面电荷分布特性发生改变，进而导致了电荷变异体的产生。相比于主峰来说，等电点较主峰高的组分称为碱性变异体，等电点较主峰低的组分称为酸性变异体。研究表明：抗体电荷的变化可以改变抗体与细胞的结合，从而影响抗体的组织穿透、分布和药代动力学(PK)。电荷变异体对于蛋白质的功能影响与其翻译后修饰的性质、修饰的位置和程度都有关，充分解析其形成的影响因素有助于蛋白药物开发中对其电荷异质性进行控制和调整。因此，对蛋白药物电荷变异体的分析显得尤为重要。

2020版《中国药典》——人用重组单克隆抗体制品总论中明确规定：需采用适宜的方法检测供试品的电荷变异体，如cIEF、CZE、IEX-HPLC等方法。2025版《中国药典》——通则3129 单抗电荷变异体测定法（公示稿）中详细阐述了cIEF和icIEF进行电荷变异体分析的具体流程。在cIEF和icIEF方法中，可以使用已知等电点的标准品计算得到蛋白药物准确的等电点信息，并能够准确获得酸碱变异体的含量信息；IEX-HPLC和CZE方法均能够获得不同酸碱变异体的含量信息，但是无法获得等电点信息。上述提及方法均只能提供变异体的定量信息，但是没法实现准确的电荷变异体鉴定。

为了更好的实现蛋白药物电荷变异体的有效鉴定，科学家们先后发展了多种检测方法。IEX-HPLC是一种经典的基于电荷差异进行分离的液相色谱分析技术，可以对不同电荷变异体进行离线收集，再结合高分辨质谱进行鉴定。在此期间，针对不同的蛋白药物需要优化组分收集的液相条件，并且馏分收集后需要进一步采用cIEF或icIEF方法进行确认，流程非常复杂，耗时长，效率低。此外，基于icIEF分离原理的离线组分收集结合质谱鉴定的方法也同样存在流程复杂，耗时长的问题，并且由于CE进样量更少，组分收集和确认的时间也会更长。

近年来，为了实现蛋白药物电荷异构体的鉴定，陆续出现了一些可以将cIEF和CZE方法与质谱系统进行在线联用的毛细管电泳仪，但是均有不足。其中，基于cIEF-MS分析的仪器，一方面由于仪器硬件设计方面的原因，分离毛细管长度过长或盲区（从分离毛细管出口到达质谱锥孔的距离）较长，致使其峰型变差，并且仪器操作的简便性欠佳；另一方面由于采用了压力迁移的方式，进一步会影响到峰型，导致分离度和灵敏度均较低。CZE-MS方法目前虽然有商品化的仪器和方案，但是分离度远不如cIEF，无法实现电荷变异体的在线聚焦，灵敏度明显较cIEF-MS差；并且没有光学检测器，无法实现电荷变异体的定量分析。

为了更好的帮助生物药企业实现蛋白药物电荷变异体的快速高效鉴定，加快药物申报进程，SCIEX于2023推出了高性能的Intabio ZT毛细管电泳质谱联用系统，创新性的采用了微流控芯片作为分离通道，实现了在线直接联用的icIEF-MS分析，并且与高分辨质谱ZenoTOF^® 7600系统联用成功的弥补了现有电荷变异体鉴定分析方法的不足（如图1所示）。

图1. Intabio ZT系统与高分辨质谱ZenoTOF^® 7600系统的联用示意图

基于Intabio ZT系统而实现的icIEF-MS分析技术主要体现出如下优势：

分析速度快：
30min内即可快速完成电荷变异体的深度表征；
简单高效：
单针进样即可获得多个质量属性：
UV检测器：等电点(pI)、电荷变异体定量
MS检测器：变异体的完整蛋白分子量、翻译后修饰、N-糖型
分辨率高：
采用化学迁移方式，样品峰型好，不影响分辨率；
盲区短（仅有4.6 mm），避免峰型展宽；
灵敏度高：
iCIEF通过聚焦对样品进行在线浓缩；

Intabio ZT系统的超低流速带来了超高的离子化效率；

icIEF-MS方法可贯穿于生物药研发的多个阶段，样品消耗量非常少，特别适合早期研发过程中克隆筛选及工艺参数的优化。以下列举了两个具体的应用案例，充分展示了icIEF-MS在电荷变异体鉴定中的技术优势。

案例分享1：化繁为简——单抗电荷变异体快速高效深度表征及鉴定

图2. NIST单抗icIEF-UV、icIEF-MS分析谱图及去卷积谱图展示

图2详细展示了Intabio ZT系统对NIST单抗电荷变异体的深度表征及鉴定结果，其中图2A~C分别为icIEF-UV谱图、icIEF-MS谱图及其去卷积结果。通过图2A和2B的比较，icIEF-UV谱图和icIEF-MS谱图呈现镜像关系，分析结果一致。通过去卷积分析结果可以清楚地看到，碱性变异体的产生主要是由于C-端的赖氨酸未丢失引起的。酸性变异体主要来源于不同程度的糖基化，主要表现为高甘露糖糖型以及复杂糖型（如NeuAc/GlcNAc）。

以上结果可以看出：在SCIEX高性能的Intabio ZT系统上，仅需30 min，通过一针进样即可获得蛋白药物的多种质量属性，包括等电点、分子量、糖型、翻译后修饰等信息，分析时间快，检测效率高。

图3. Intabio ZT系统重复性结果展示

图3主要展示了在3套Intabio ZT系统上、各使用了3个卡盒、每个卡盒各运行了20针测试，共计180针分析的重复性结果。可以看出在不同仪器上、使用不同的卡盒、同一卡盒的不同测试间均表现出优异的重复性。图3B为不同酸碱变异体的相对含量对比结果图，可以看出Intabio ZT系统电荷变异体定量分析的结果一致性好。通过右表可以看出，不同酸碱变异体的pI值RSD均小于1%；主峰的峰面积百分比RSD小于2%。

结果证明：在SCIEX Intabio ZT系统上，蛋白药物电荷变异体的定性和定量分析结果的重复性好。

案例分享2：快速监控ADC药物中小分子毒素的偶联情况及其电荷异构体鉴定

图4. 某赖氨酸偶联ADC icIEF-MS电荷变异体鉴定结果展示

ADC药物是通过连接子将具有生物活性的小分子药物偶联至单抗上而产生的，其生产工艺复杂，小分子药物的偶联以及各种翻译后修饰（糖基化、糖化、脱酰胺化等）的发生，将会导致ADC药物的电荷异质性明显增强。如何快速高效的研究ADC药物的电荷变异体，是很多ADC制药企业迫切需要解决的问题之一。如图4为某赖氨酸偶联的ADC药物icIEF-MS分析的结果，通过对图4A和4B的比较可以看出：偶联了小分子药物之后，ADC药物的电荷异质性明显增强，酸性变异体增多。

图4C所示为icIEF-MS去卷积结果，可以清晰的看出：每一个电荷变异体中存在不同的糖基化形式，糖型主要表现为G0和G0F；Peak 0~8分别对应于偶联不同个数小分子药物（0~8个）的ADC变异体，随着小分子药物偶联个数的逐渐增加，结合不同糖基化修饰的存在，对应ADC药物电荷变异体的等电点逐也渐降低。