LightCycler应用：甲基化分析

主要应用:

应用实时荧光PCR技术进行快速准确的DNA甲基化分析

DNA甲基化是表观遗传学的重要研究内容之一，它可以在转录水平抑制基因的表达。具体的过程是在胞嘧啶－鸟嘧啶（CpG二核苷酸）的5位碳原子上添加了一个额外的甲基团，形成5－甲基胞嘧啶。CpG二核苷酸密度较高的区域在人体基因组中呈非随机分布于，优先分布于基因的启动子区，并被称为CpG岛[1]。对于癌症，其基因组的甲基化分布发生变化[2]。正常状态下应甲基化的区域未甲基化，而症状状态下非甲基化区域出现甲基化，例如CpG岛相关启动子呈超甲基化。这可导致受累基因座的染色质结构发生变化，致使基因沉默。启动子超甲基化可导致有关肿瘤演进的重要基因再次沉默，例如那些有关DNA修复、细胞周期调控和凋亡的基因。因此，可以认为DNA甲基化与肿瘤研究密切相关。肿瘤中某些基因的DNA甲基化状态的变化通过其生物学特征反映出来。因此，评估DNA甲基化的快速高通量方法对研究者和临床医生在诊断、治疗和预后都非常有实用价值[3].

当前对于DNA甲基化研究，普遍使用的方法有甲基化特异性PCR，变性高效液相色谱法（DHPLC），联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（COBRA）等，这些方法各有优势，但是均存在诸如实验设计复杂，易产生假阴性或假阳性等问题，提示科学家寻找更加容易且准确的分析手段。

甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）是近年兴起的一种适用于评估特定基因DNA甲基化的新技术[4]。它基于当前实时荧光PCR仪器的前沿应用 – 高分辨率熔解曲线分析（HRM），使用既可扩增甲基化序列也可扩增非甲基化序列的引物对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5－甲基胞嘧啶保持不变，随后通过PCR扩增检测感兴趣区域的甲基化状态。在MS-HRM中，在饱和的DNA结合染料存在的情况下进行PCR反应，在扩增后进行高分辨熔解曲线分析，HRM分析的特点为可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源于甲基化还是非甲基化的初始模板变异体。MS-HRM可评估引物之间整条扩增子的甲基化状态。由于它是一种闭管方法，可初步快速评估甲基化。相比于传统的方法，它的成本低廉，分辨率高，通量灵活（最多一次筛查384个样本，最少几个样本），并且准确率大大提升。结合标准品的特征熔解曲线，还可以对样本中存在的甲基化DNA比率进行基本的定量。

更多有关特定CpG位点的甲基化的详细信息，可采用重亚硫酸氢盐修饰后测序分析。

我们使用罗氏诊断公司的LightCycler®480高分辨熔解扩增试剂盒在LightCycler®480实时荧光PCR仪上，通过MS-HRM测定法对两种已知的经过启动子（FANCE和MGMT）甲基化的DNA修复基因的检测性能。

材料和方法

将多种细胞株的DNA样本作为检测模板。每μg的每种DNA样本都经过重亚硫酸盐修饰。通过在正常DNA（经过重亚硫酸盐修饰）池中按50％、25％、10%、5％和1％稀释100％的甲基化对照DNA（经过重亚硫酸盐修饰）以创建甲基化标准品。MS-HRM引物按Wojdacz和Hansen描述的方法设计[5]。使用LightCycler®480高分辨熔解扩增试剂盒在96孔LightCycler®480仪器中执行扩增和熔解反应。

图1：（a）含100％甲基化和非甲基化质控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化标准品的FANCE MS-HRM测定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因扫描”软件模块分析的数据。（b）含100％甲基化和非甲基化质控品和50％、25％、10％、5％和1％的甲基化标准品的MGMT MS-HRM测定法。使用“Tm Calling”和“HRM基因扫描”软件模块分析的数据。

图2：（a）FANCF MS-HRM测定，显示稀释卵巢癌细胞株2008中存在DNA甲基化。（b）MGMT MS-HRM测定，显示乳腺癌细胞株MDA-MB435和HS578T中存在甲基化。

结果和讨论:

针对两个基因的MS-HRM测定法都可检出非甲基化DNA背景下1％的甲基化DNA。图1显示MGMT的测定和FANCF测定相比，在该试验使用的引物退火温度（58℃）条件下可更加明确的识别稀释比更低的甲基化标准品。图2显示使用FANCF和MGMT MS-HRM测定法筛查多种细胞株的甲基化状态。图2a显示通过FANCF筛查的九种细胞株中只有卵巢癌细胞株2008存在甲基化，其样本熔解特征曲线与100％的甲基化质控品相似。研究的其它细胞株通过FANCF检测为非甲基化结果。图2b显示通过MGMT检测出乳腺癌细胞株MDA-MB435存在甲基化。该样本的曲线特征再次与100％的甲基化质控品相似。HS578T乳腺癌细胞株非常有趣，因为它的熔解曲线与非甲基化和甲基化曲线都不同。该曲线以检测区出现异质性甲基化为特征。

LightCycler® 480实时荧光PCR仪是一款非常适合进行HRM的实时荧光PCR仪器，配合使用LightCycler® 480高分辨熔解扩增试剂盒，即成为了一套执行甲基化敏感性高分辨熔解分析（MS-HRM）检测的可靠平台，允许快速高通量研究DNA甲基化。相信这个新的研究方法的推出可以有效加快表观遗传学的研究进程，做到更快、更准、更好。

参考文献:
1. Bird AP (1986) Nature 321: 209–213
2. Jones PA, Baylin SB (2002) Nat Rev Genet 3: 415–428
3. Dobrovic A In: Coleman WB, Tsongalis GJ (eds) Molecular Diagnostics for the Clinical Laboratorian, pp 149–160. Humana Press, Totowa, USA (2005)
4. Wojdacz TK, Dobrovic A (2007) Nucleic Acids Res 35: e41
5. Wojdacz TK, Hansen LL (2006) Biotechniques 41: 274, 276, 27