MALDITOFMS在突变检测中的应用

　　近年来随着精准医疗的需求，临床中提出了越来越多的检测需求。以非小细胞肺癌为例，EGFR、KRAS、BRAF、ALK、ROS1、RET、MET、HER-2已经成为临床中常用的检测需求。

　　目前检测中，常以荧光定量方法检测mutation，FISH方法检测fusion，或者采用NGS技术进行检测。EGFR需要检测的位点散布在18、19、20、21号外显子上，采用荧光定量方法往往不能在一个反应体系中进行检测，需要多个反应来完成一个样本的EGFR基因检测，对样本量有一定的需求，且由于荧光定量方法需要根据CT值进行结果的判断，当CT值在35~40个循环时，往往很难判断。

　　利用NGS技术检测在样本量不足以支持一次运行时，成本往往偏高，且整个NGS的流程往往需要3~5天时间方可得到实验结果，对于报告的速度有一定的限制。那么有没有一种技术在检测位点较多时还可以保证以一个较快的时间较低的样本个数需求完成检测呢？

　　MALDI-TOFMS是一个较优的解决方案。主要由基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）组成。其原理是利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。

　　而后离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。

　　基于MALDI-TOFMS技术的MassARRAY系统是使用质谱分析精确测量PCR衍生的扩增子的非荧光检测平台。质谱分析与终点法PCR相结合，在通用的循环条件下实现了高度多重性的反应，以提供精确、快速且经济高效的分析。MassARRAY系统利用有限的加入样本为靶向基因检测提供了独特的解决方案。

　　主要流程分为PCR Reaction——iPLEX Extension Reaction——Mass Spectrometry Analysis首先通过普通PCR扩增得到目的区段，而后通过在待测位点上游1bp位置延伸引物进行1bp的延伸反应，使产物形成末端为突变型位点/野生型位点的片段，最后将产物进行MALDI-TOFMS检测，最终质荷比（M/Z）与飞行时间成正比例的关系即可得到样本在特定位点的变异情况。

　　MassARRAY系统，配合相应的试剂，可测试各种类型的样本，包括FFPE、cfDNA、基因组DNA等。

　　此外：

　　· 较高的灵活性：每孔可进行 10-50重PCR反应，最高可达60重。

　　· 高性价比：同时测定10-50个SNP位点，无需荧光标记，耗材成本和样本用量最低。

　　• 高准确度：通过正反双向设计引物，能有效检测插入缺失INDEL和融合基因。

　　• 超高灵敏度：液体活检，从血浆cfDNA中检出0.1%肿瘤体细胞突变。

　　• 高样本通量：每天可处理样品数 3,000以上，100,000个基因分型。

　　• 低DNA样本量和质量要求：每组PCR 反应只需10 ng DNA，可以检测FFPE石蜡包埋的降解至100bp的样本。

　　• 高质量数据：全自动分析数据，完成基因分型报告，并赋予质谱获得样品状态及结果可信度分析。

　　• 甲基化检测：单个反应可定量检测500-600bp片段上的多个CpG位点的甲基化频率。无需设计CpG位点特异性引物，全自动化数据报告。可对整个启动子的CpG岛上的甲基化作定位、定量分析。