NGS文库制备新品实现5hmC分析

　　近年来，新一代测序(NGS)平台在甲基化研究中开始崭露头角。它们带来了非常灵敏的DNA甲基化图谱，以单分子分辨率覆盖整个CpG岛。然而，对于时下热门的5-hmC研究，似乎还缺乏专门的样品制备工具。为此，Zymo Research公司近日推出两款新的NGS文库制备试剂盒，适用于全基因组范围的5-hmC和5-mC分析。

　　5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)是这几年备受关注的一种表观遗传学修饰，可能参与了DNA去甲基化或基因表达调控。对于全基因组范围的甲基化分析，亚硫酸氢盐测序是一种常用方法，但无法区分5-mC和5-hmC。

　　Zymo Research此次为5-hmC研究带来了RRHP™ 5-hmC文库制备试剂盒(RRHP™ 5-hmC Library Prep Kit)，利用对不同甲基化状态敏感的MspI来制备测序文库。它的操作流程如下：首先用MspI消化基因组DNA，然后连接接头，并用 β-葡萄糖基转移酶在5-hmC的羟基上添加葡萄糖，从而防止接头被消化。之后再次进行MspI消化，而那些缺乏5-hmC的片段接头将被消化。只有两侧带有完整接头的片段能够被扩增，用于后续的测序。

　　由此看来，这一过程并不复杂，不需要亚硫酸氢盐转化，只是多了几步酶切和回收。样品量的要求也不高，不少于100 ng基因组DNA即可。此系统制备的文库与Illumina的HiSeq和MiSeq测序平台兼容。

　　同时，Zymo Research也推出另一款Pico Methyl-Seq™文库制备试剂盒(Pico Methyl-Seq™ Library Prep Kit)，适用于常规的亚硫酸氢盐测序。这款试剂盒的独特之处在于起始量特别低，只需要10 pg – 100 ng基因组DNA，特别适合珍贵样品(如FFPE)或靶向富集样品的甲基化分析。

　　在亚硫酸氢盐测序中，传统的文库制备方法通常要将基因组DNA片段化，末端修复，连上接头，亚硫酸氢盐转化，接着进行扩增。这需要大量的DNA以及多次纯化，导致珍贵的DNA样品损失。而此试剂盒先开展亚硫酸氢盐转化，接着采用独特设计的引物进行三轮的扩增，从而实现了微量样品的分析。与上面介绍的RRHP™ 5-hmC文库制备试剂盒一样，此系统也与HiSeq和MiSeq测序平台兼容。