NGS样品制备：来自五位专家的建议

　　对于新一代测序（NGS）而言，样品制备的重要性不言而喻。每次测序的成本可不低，若样品制备得不好，则实验就会彻底糊掉。在此，五位专家就如何改善NGS的样品制备过程，提出了他们的宝贵建议。

　　欧洲分子生物学实验室（EMBL）的技术人员Ferris Jung：

　　你需要密切留意起始材料的质量。无论样品制备的过程有多完美，产物的质量都不会优于起始材料。此外，你需要确保实验结果在文库制备试剂盒的参数范围内。大多数试剂盒的结果高于或低于建议的参数，但这类实验要想获得成功还是有点困难。最后，为了区分异常值，你最好将实验重复三次或以上。

　　Promega的高级战略组合经理Kurtis Knox：

　　核酸质量比以往更重要。在选择纯化方法时，你需要考虑它是否能产生大量的DNA或RNA，而且生成的产物是否切实可用。花点时间和精力去进行质控和定量，尽量避免测序浪费或结果不佳。

　　PacBio的产品管理总监Paul Kotturi：

　　在使用长读长技术时，样品制备是一个重要的环节。许多方法侧重于简化流程和减少样品量，不过关键在于：

　　▪ 准确判定起始样品和最终文库的质量和大小分布。对于起始样本，你必须了解dsDNA的数量和大小分布，以确保你有足够的DNA来完成实验，并且这些DNA足够长。同样，对于最终生成的文库，你也要检测相同的指标。如果测量不准确，你加入的测序聚合酶可能过多或过少。前者会导致背景信号增加，而后者会导致加样过低。

　　▪ 将你的实验设计拿出来与经验丰富的专家讨论一下。长读长技术及相关技术一直在进步和演变。听取gDNA提取和定量、片段长度测定和长度筛选方面的建议，将帮助你获得更多信息。

　　安捷伦的高级营销总监Viresh Patel博士：

　　根据你的需求选择合适的文库制备试剂盒。需要考虑的因素包括应用、样品类型、DNA起始量、测序平台等。

　　▪ 对于材料有限的样品，如针尖穿刺或液体活检，你需要选择对DNA起始量要求低但转化效率高的产品。

　　▪ DNA浓度、DNA质量、DNA可扩增量、DNA片段长度分布等质控指标很重要，可确保结果准确，失败率低。

　　▪ 如果你有一台大容量的测序仪，那么你可以选择为样品添加序列标签（index）的文库制备方案，这样每次可运行更多的样品。

　　▪ 如果你需要检测极低频率的突变，那么你可以选择具有错误校正能力的样品制备方案。

　　▪ 最后，在选择文库制备试剂盒时，还需要考虑机械法 vs. 酶法DNA片段化、是否兼容FFPE、手动操作时间、整体周转时间以及试剂成本等因素。

　　Sage Science的营销副总裁Alex Vira：

　　NGS文库制备的最重要环节是确定起始DNA的质量和完整性，并了解文库构建过程的步骤，知道如何针对测序效率或分析类型来优化。