NatBiotechnol：利用包膜递送工具可实现在体内对T细胞进行基因编辑

　　目前大多数获批的基因疗法，包括涉及CRISPR-Cas9的基因疗法，都是对体内取出的细胞在体外进行基因编辑，然后将这些经过编辑的细胞输注回到患者体内。

　　这种技术非常适合靶向血细胞，目前新批准的治疗镰状细胞性贫血等血液疾病的CRISPR基因疗法就采用了这种方法，即在化疗破坏了患者的骨髓后，将经过基因编辑的血细胞重新注入患者体内。

　　如今，在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校的研究人员开发了一种新的CRISPR-Cas9精准靶向递送方法，能在患者体内对非常特定的细胞亚群进行基因编辑，这是朝着无需在给患者注射经过基因编辑的血细胞之前破坏他们的骨髓和免疫系统的可编程递送方法迈出的一步。相关研究结果于2024年1月11日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“In vivo human T cell engineering with enveloped delivery vehicles”。

　　CRISPR-Cas9基因组编辑技术的共同发明人Jennifer Doudna在加州大学伯克利分校的实验室里开发出了这种递送方法，它将Cas9编辑蛋白和向导RNA（gRNA）包裹在一种装饰有单克隆抗体片段的膜泡中，而这些单克隆抗体片段片段能够靶向特定类型的血细胞。

　　Doudna实验室的CRISPR研究员Jennifer Hamilton通过靶向免疫系统的一种细胞——T细胞进行了验证，其中T细胞是一种革命性癌症疗法——嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的起点。

　　Hamilton和她的同事们对配备了人源化免疫系统的活体小鼠进行了治疗，将它们的人类T细胞转化为CAR-T细胞，使其能够靶向消除另一类免疫细胞——B细胞。

　　Hamilton说，这一壮举是一个原理上的证明，显示了使用这种载体方法，包膜递送工具来靶向和编辑活体动物（体内）的血细胞和可能的其他类型细胞的潜力，以及最终也能用于人类的潜力。

　　Hamilton说，“我们的方法涉及靶向分子的复用，也就是说，在我们的膜泡上有两种或更多的靶向分子，它们与靶细胞的相互作用有点像计算机中的与门”，即指的是只有当两个事件同时发生时才起作用的逻辑电路。

　　图片来自Nature Biotechnology, 2024, doi:10.1038/s41587-023-02085-z

　　“当膜泡使用两种抗体配体相互作用结合时，我们能够获得更有效的递送。在用T细胞靶向载体治疗小鼠后，我们在我们感兴趣的细胞类型T细胞而不是肝细胞中观察到基因组编辑。”

　　她说，高度特异性靶向对于所有向细胞递送基因的方法来说都很困难。特别是肝细胞，它们经常会摄取递送到其他地方的递送工具。

　　病毒包膜

　　Hamilton和她的团队正在研究几种递送基因疗法的实验技术之一。其中许多技术使用有包膜病毒的外壳---将病毒掏空，并填充校正性转基因或者基因编辑工具，如CRISPR-Cas9。其他方法依赖于直接向小鼠体内注射穿透细胞的Cas9蛋白来实现基因组编辑。

　　Hamilton在攻读博士学位时研究的是流感病毒等有包膜病毒，她的研究重点是对这类病毒进行基因改造，因为它们有更灵活的外壳。

　　在2021年的一篇论文中，她证实了HIV-1病毒的外包膜被掏空并填充了Cas9后，可以编辑体外培养的T细胞并将其转化为CAR-T细胞。从那时起，她对病毒包膜进行了很大的改变，如今她把它们称为包膜递送工具（enveloped delivery vehicle, EDV）。

　　EDV 的一个重要方面是，它们的外包膜可以很容易地装饰上多个抗体片段或靶向配体，从而大大提高了靶向特异性。事实已证实，腺相关病毒和脂质纳米颗粒等其他基因递送载体较难实现精确靶向。

　　Hamilton说，“人们正在努力对所有这些载体进行重新靶向，使其对一种细胞类型具有特异性，并防止向其他细胞类型递送基因。你可以展示抗体或抗体片段，就像我们一直在做的那样，但旁观者细胞的摄取率仍然很高。你可以偏向于向一种细胞类型进行递送，但你仍然可以观察到旁观者细胞的摄取。在我们的论文中，我们实际上观察了肝脏，看看是否有脱靶的情况，结果没有。我认为，用更传统的非包膜病毒载体或脂质纳米颗粒来实现这一点更具挑战性。”

　　在这篇论文中，Hamilton和她的同事试图在体内复制一种成功用于癌症患者的体外CRISPR CAR-T细胞疗法。该疗法不仅递送编码一种靶向癌细胞的受体的转基因，还利用CRISPR技术敲除了不靶向癌症的受体。

　　这些作者成功地敲除了天然的T细胞受体，并递送编码一种靶向B细胞的受体的转基因。由于Cas9蛋白与转基因是在同一个EDV中递送的，因此与递送Cas9基因的方法相比，它的寿命更短，这意味着脱靶编辑更少。

　　Hamilton说，“在这篇论文中，我们试图实现的是跳过在体外对细胞进行基因编辑的整个步骤。我们的目标是系统性地给送一种载体，它既能进行基因递送，又能在体内特定细胞类型中进行基因敲除。我们利用这种递送策略在体内制造经过基因编辑的CAR-T细胞，希望能够简化在体外制造经过基因编辑的CAR-T细胞的复杂过程。”

　　Doudna 和她的实验室将继续提高 EDV 介导的递送效率。Hamilton正在进一步开发这种递送方法。

　　Doudna写道，“允许在体内提供基因编辑疗法的新技术和改进的生产工艺将是降低价格的关键，大学、政府和企业之间独特的合作关系也将是降低价格的关键，这些合作关系的共同目标是让人们能够负担得起。仅仅制造这些递送工具是不够的。我们必须确保最需要的人能够用得起这些工具。”