Nature子刊：双功能CRISPRCas9，可同步实现基因编辑和调控

　　哈佛医学院著名遗传学家George Church教授是基因编辑技术的鼻祖之一：2年前张锋使用CRISPR技术完成了多重基因组编辑，Church则使用CRISPR技术完成了RNA介导的人类基因组编辑。

　　自此之后，CRISPR/Cas9技术持续火爆，方便快捷的方式迅速风靡科研界，不论是医学研究，农学研究，微生物研究，都对其投入巨大精力。迄今为止，从PubMed数据库中查询，关于Cas9的文章共有951篇，其中最新的一篇是9月7日的Nature子刊——Nature Methods报道了哈佛大学和麻省理工的研究团队开发了双重功能的CRISPR-Cas9系统，能够同时实现基因组编辑和基因调控。

　　过去：基因编辑和基因调控需要用到不同的Cas9蛋白

　　众所周知，Cas9是蛋白RNA复合物，其中的小型引导RNA识别特定DNA序列的能力。不论是基因编辑还是基因调控，CRISPR-Cas9的第一步是相同的：引导RNA通过序列互补原则将Cas9带到基因组特定位点，使其与目的基因结合。不过到目前为止，基因编辑和基因调控需要用到不同的Cas9蛋白。基因编辑依赖Cas9的DNA剪切活性；而基因调控需要抑制其剪切活性，只保留Cas9结合靶标基因的能力。在过去，基因调控所用的Cas9变体通常与调控基因表达的蛋白融合在一起。

　　双重功能的CRISPR-Cas9系统，可同步实现基因编辑和调控

　　哈佛大学的George Church教授和麻省理工的Ron Weiss教授共同领衔的研究团队开发了一个新策略，成功用一种Cas9同时完成基因编辑和基因调控两项任务。gRNA又称引导RNA，真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA。引导RNA为模板的插入编辑，即RNA编辑所需要的信息或者来自向导RNA，或者来自被编辑的RNA自身。

　　引导RNA的编辑过程

　　CRISPR/Cas9的成功与否的关键问题在于gRNA的设计，gRNA和非目标区域过多的非特异性结果，脱靶效率较高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的区有高同源性。目前为了提供基因组操作的准确性，对Cas9核酸酶进行了突变，突变后的Cas9n 只能切割DNA双链中的一条链，通过两个gRNA引导Cas9对DNA切割：gRNA-I首先以其5’端与前体RNA互补配对，从3’向5’方向插入UMP；gRNA-II继续完成编辑的全过程。该方法可以显著提高基因组编辑的特异性，降低脱靶效率。

　　选择适合的引导RNA的长度是关键

　　文章的第一作者之一Alejandro Chavez博士表示：在决定Cas9结合DNA之后是否进行切割过程中，引导RNA的长度起到了关键性作用；过度截短引导RNA使Cas9不能切割其基因组靶点；不过截短引导RNA并不影响Cas9与靶基因的结合。人们可以在此基础上，用Cas9把基因调控蛋白送到特定的基因上，即在此基础上改造的引导RNA和化脓性链球菌的Cas9蛋白，在切割特定基因的同时也可调控其他基因的表达。

　　双功能CRISPR-Cas9发现的实际应用意义

　　Church教授表示，以后人类可以根据引导RNA的最适合长度原则，用一种蛋白获得对基因序列和基因表达的直接控制，使得几乎所有DNA都能转变为调控序列，从而进一步操纵细胞。其实际应用意义有2方面：一是揭示重要过程背后的复杂互作（比如癌症耐药性和干细胞分化）；二是设计更高级的人工基因回路。

　　文章的一位共同作者Marcelle Tuttle博士则表示，双功能CRISPR-Cas9可以提升破解致病基因之间的复杂关系的能力；还可以用于工业领域，促进基因工程菌株（E. coli等）大规模生产化合物和燃料，同时保护这些菌株不被其他病原体感染。

　　Wyss研究所的Donald Ingber博士说认为，此项研究显著提高了CRISPR-Cas9的控制水平，进一步拓展了这一系统的应用范围。