NatureMethods发布CRISPR／Cas9新技术

　　麻州大学医学院的科学家们开发出了一种新的CRISPR/Cas9技术，其可以精确地在几乎所有的基因组位点如外科手术般编辑DNA，同时避免标准CRISPR基因编辑技术中看见的一些潜在的有害脱靶改变。通过配对CRISPR/Cas9系统与一个可编程的DNA结合结构域(CRISPR/Cas9-pDBD)，研究人员创立了一个额外的校对步骤来提高这一基因编辑系统的准确性，从而为潜在的临床和基因治疗应用打开了大门。这项研究发布在《自然方法》（Nature Methods）杂志上。

　　麻州大学医学院分子、细胞与癌症生物学副教授Scot Wolfe说：“尽管标准CRISPR/Cas9系统擅长在体外利用一条单导向RNA造成基因组断裂，这一技术却并不适合大多数基因治疗应用，因为基因治疗涉及编辑大量细胞，把对基因组的附带损害降至最小至关重要。因此我们给这一系统增加了一个额外的校对步骤。通过让一个锌指DNA结合结构域与CRISPR/Cas9系统融合，现在在切割基因组之前它可以验证预期靶位点中另外的一个遗传特征。我们已证实这可以将CRISPR/Cas9的精确度提高近100倍。”

　　麻州大学医学院的研究人员已开发这一核酸酶平台来切除感染细胞基因组中的潜伏HIV原病毒，并有潜力纠正导致慢性肉芽肿疾病的遗传突变——这一遗传病使得免疫细胞无法形成杀死某些细菌和真菌病原体所需的活性化合物。

　　CRISPR/Cas9是细菌利用来保护自身抵御噬菌体及其他类型外源遗传物质的一种适应性免疫系统。它包含两个元件：分子剪刀Cas9可有效切割DNA，但被限制在它的天然状态；RNA导向复合物可在发现匹配的遗传序列，确定确切切割位点时开启这一剪刀。这些导向RNA是由CRISPR序列生成，CRISPR序列中包含以往病毒感染的基因组残余物。通过装备Cas9核酸酶来靶向和失活这些病毒，CRISPR/Cas9系统为细菌细胞提供了适应性免疫防御。

　　科学家们可以采用人造导向RNAs来重编程CRISPR/Cas9系统，切割哺乳动物基因组内的序列，将新的遗传信息片段如外科手术般插入到细胞中。作为一种简单且高效的基因组编辑方法，CRISPR/Cas9正在彻底改变生物医学研究，使得在细胞系中失活或激活基因实现研究目的变得更加容易。它还简化了构建用来研究人类疾病的动物疾病模型。过去需要数月或数年的工作现在可在数周内完成。

　　尽管CRISPR/Cas9系统很强大，但它却并不完美。有时候导向RNA会将切割酶调遣到基因组内的正确位置，也会让切割酶定位到与靶位点相似但却不完全相同的其他序列处。在构成人类基因组的60亿个核苷酸中可发生100次位点错配，有时候切割这些错配位点可造成意想不到的伤害。

　　“尽管并不是所有100个位点都会被切割，如果你改变了数百万的细胞，就像你在许多潜在临床应用中所做的那样，你将会有一些机会在非预期的位置造成断裂和新插入。这可以导致局部突变或基因组重排，有可能会引起诸如癌症等问题，”Wolfe博士说。

　　锌指结构域是一些可以设计来结合基因组特异区域的蛋白质。通过组合DNA结合锌指结构域和CRISPR/Cas9系统高效切割机制及RNA导向，Wolfe和同事们构建出了一个高效且更准确的新系统。在当前的研究中，他的研究小组证实当组合CRISPR/Cas9与一种锌指DNA结合结构域之时，与靶向两个不同基因组位点相关的脱靶切割事件将至无法检测到的水平。在第三个靶向位点，脱靶切割事件的数量降低了10倍。

　　Wolfe说：“我们所做的就像为CRISPR/Cas9创造了一个GPS。通过组合DNA结合结构域与CRISPR/Cas9，我们构建了一个令人兴奋的新技术平台，可将需要接受基因治疗的患者潜在风险降至最小。”

　　与儿科和分子、细胞与癌症生物学教授Peter E. Newburger博士，及分子医学教授Erik J. Sontheimer合作，Wolfe和他的研究小组正在开发这一改良的Cas9系统，在体外直接修复来自慢性肉芽肿患者的造血干细胞中的致病突变。最终目的是将纠正细胞再度导入患者体内恢复他们的免疫功能。Wolfe还在与艾滋病研究级分子医学教授Jeremy Luban博士，麻州大学医学院的一组同事一起，开发这些核酸酶有效及精确地删除感染细胞中的潜伏HIV病毒。