Nature：5种RNA测序法终极PK

　　近日，美国哈佛大学与麻省理工学院的研究人员，将5种不同的转录组测序( RNA -seq )法进行了对比，比较结果显示 RNAse H 技术在分析低质 RNA 样品方面优于其他技术，且价格最为便宜; SMART 和 NuGEN 法适应于分析少量 RNA 。两篇研究论文在线发表在5月19日的《自然方法》(Nature Methods)和《自然》(Nature)杂志上。

　　由于RNA 在一段时间内会发生降解，研究人员一直在寻找一种方法来解决这一问题。研究人员尝试了不同的方法，最终发现 RNAse H 法很好用，能够给出一致的结果。

　　RNA-seq 是一种利用高通量序列测定，来测序和定量 RNA 进行转录组分析的方法。然而当研究人员利用少量降解或少量残存的样本进行 RNA -seq 时，他们得到的是受损的结果。Adiconis说，当前有许多的方法和商业试剂盒可用于分析低质和低量的样本，但直到现在人们也只能在某种程度上依靠猜测对这些方法进行选择。

　　在第一项发表在《Nature Methods》的研究中，研究小组通过测试这些技术清除低质样本中核糖体 RNA(rRNA )的能力，发现 RNAse H 能够清除低质样本中几乎所有的rRNA ，只有 1% 的量残存。而 Ribo-Zero 法留下了 11.3% ,的 rRNA ， NuGEN 法留下了23.2%。此外，对于低质 RNA ， RNAse H 和Ribo-Zero法在大多数量度，例如文库复杂性(样本中文库复杂性越高，就越能更好地代表 RNA )和覆盖均匀度等方面看起来更优。

　　研究小组随后采用真实样本：一个福尔马林固定、石蜡包埋的肾样本，以及一个分离过程中发生了降解的胰腺样本，比较了 RNAse H 和Ribo-Zero。最终，科学家们发现 RNAse H优于Ribo-Zero，提供了略微更均匀的覆盖。

　　鉴于它们在特异针对性清除 rRNA 序列方式上的根本差异，总体而言， RNAseH 和 Ribo-Zero 优于其他的方法。例如， RNAse H法是采用预先设计的DNA寡核苷酸结合核糖体 RNA 序列，随后 RNAse H 酶消化DNA- RNA 杂交物。研究人员表示，这种靶向性的方法相对不影响剩余的转录组。

　　相比之下，其他的方法，如 polyA 筛选法、DSM 和 SMART ，是通过筛选多聚腺苷酸mRNA (poly-adenylated mRNA )或是清除高度丰富的 RNA 种类的方法，来间接清除核糖体 RNA 。这些技术在清除核糖体 RNA 的同时，也引入了降解样品覆盖偏倚。

　　此外，Ribo-Zero、 NuGEN 和 SMART 商业试剂盒一个样本的成本，要大大高于 DSN-lite 和 RNAse H 等其他方法。组装这些文库所需的劳动量大致相同，除了 DSN-lite 需要多一天之外。

　　尽管 RNAse H 看起来是一个明显的赢家，一种方法的选择要主要是取决于研究目的。例如， NuGEN 能够极好地应用于非常量小的样本。研究人员表在，这项研究中测试是1 ng和100 ng的样本量，但实际 NuGEN 方法可以达到比这更低。它也非常适用于已经降解的 RNA 。

　　SMART 方法也适用于微小样本，不过其要求 RNA 必须是完整的。

　　而在另一项发表在《Nature》杂志上的研究中，研究人员利用 SMART 方法对单个免疫细胞的转录组进行了测序，揭示了这些单细胞在基因表达上的异质性。

　　研究小组过去一直采用 NuGEN 来测量单个病毒颗粒的转录组，单个病毒颗粒的 RNA 量不超过 1 皮克。研究人员表示，由于从未尝试过用 NuGEN 法来检测单细胞，因此无法判定哪个更好一些。