Northern印迹分析
杂交和放射自显影
| 试剂、试剂盒 | 甲醛凝胶溶液 RNA 电泳缓冲液 |
|---|---|
| 仪器、耗材 | 凝胶模 梳齿 凝胶用具 |
| 实验步骤 | 1. 用肥皂和水彻底清洗凝胶模，梳齿和凝胶用具。 2. 准备甲醛凝胶溶液。 甲醛凝胶溶液（300 ml 1％ 琼脂糖凝胶）： 琼脂糖，3.0 g 10x RNA 电泳缓冲液，30 ml Milli-Q 或用玻璃器皿蒸馏过的水，222 ml 37% 甲醛，48 ml 加热熔解琼脂糖。冷却到 55℃（用温度计检査）后加甲醛。在通风橱中倒胶。 10x RNA 电泳缓冲液（配 500 ml）： 0.2 mol/L MOPS，pH 7.4 1 mol/L MOPS，pH 7.4 100 ml 10 mmol/L EDTA，pH 7.4 0.5 mol/L EDTA，pH 7 10 ml Milli-Q H2O 390 ml 贮存于 4℃，避光。 3. 10 μl 总 RNA 和 30 μl 1.33x RNA 上样缓冲液混合。  4. RNA 样品在 65℃ 水浴中加热 15 分钟以破坏 RNA 的二级结构。从水浴拿出并立即在冰上放 2 分钟。 5. 样品在小离心机上短暂离心（5 秒）使所有液体都流到管底。把样品放回冰盒。在已准备好的凝胶中上样。 6. 以 2.5~5 V/cm 凝胶长度进行凝胶电泳，直到溴酚兰染料的前沿移动到大约 2/3 凝胶长度处。 7. 给凝胶照相。先在紫外灯盒子上铺一张干净的塑料膜，然后再把凝胶放到上面。 8. 用毛细转移或电印迹法把 RNA 转移到尼龙膜上。 (1) 毛细转移法 ① 用 Milli-Q 或用玻璃器皿蒸馏过的水稍微洗一下凝胶。 ② 在准备转移前，把膜、滤纸和纸巾切成合适的大小。对于毛细转移法，液体必须在被纸巾堆吸收前通过膜。如果让纸巾或滤纸接触凝胶或滤纸条，就会发生“短路”这种情况可以通过依次缩小膜、滤纸和纸巾的大小来避免。 这里给出的尺寸是用于 20 cm x 20 cm 的凝胶。对于不同大小的凝胶要调整尺寸。  ③ 在 20x SSC 里打湿滤纸条（26x35 cm 滤纸）并把它铺在一块玻璃平板上使两端垂在盛有 1120X SSC 的平皿中。取一根玻璃吸管用作擀面杖，去掉所有玻璃和滤纸之间的气泡。 ④ 凝胶放在滤纸条上。 ⑤ 先在水中然后在 20X SSC 中把膜打湿，接着把膜放到凝胶上。用玻璃吸管去掉所有气泡。 ⑥ 滤纸（18.5 cm x 18.5 cm）在 20x SSC 中打湿，然后放到膜上并确定是放在中间位置。用玻璃吸管去掉气泡。 ⑦ 把纸巾堆放在滤纸上（中间）。 ⑧ 纸巾上盖一个玻璃或塑料盘（如用于倒胶的托盘）并在上面压重物（例如一个放满液体的 50 ml 瓶子）。 ⑨ 凝胶转移 8~16 小时。 (2) 电印迹法 ① 用 Milli-Q 或用玻璃器皿蒸馏过的水洗凝胶两次（4 倍凝胶体积，每次洗 15 分钟），再用 1x TAE 洗一次（4 倍凝胶体积洗 15 分钟）。 ② 按制造商的说明组装转移装置。 ③ 在 1x TAE 中以 1 安培的电流转移 1 小时或在对等的条件下进行转移（所用的安培数依据供电的限制） 9. 拆掉转移装置。用例如 Stratalinker 的紫外交联仪把 RNA 交联到湿润的膜上。 10. 通过对膜照相以确证转移效率。在 28S 和 18SrRNA 条带的地方作标记。 11. 在 2x SSC 里洗膜，几分钟后，用你的手指（戴干净的手套）轻轻地擦拭滤膜表面以去除任何黏在上面的琼脂糖。 12. 用水洗膜，并把膜保存在干净的纸巾之间，直到准备进行杂交分析。 |
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