Northernblot实验方法

DNA

MOPS电泳buffer 甲醛凝胶加样buffer EB EGFR探针 DIG SSC

水平电泳仪 制冰机 恒温水浴箱 凝胶成像系统 EP管 移液器 Tip头

一、RNA转移与固定

1.  变性琼脂糖电泳分离总RNA样品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝胶片刻，10×SSC中浸泡平衡凝胶30 min。

2.  按southern blot实验中DNA转移方法及装置转移总RNA至尼龙膜上（过程中注意无RNA酶操作）。

3.  1×SSC淋洗尼龙膜后滤纸吸干，夹在2层干净滤纸中80℃烤箱烘烤2小时。

4.  RNA染色，干燥的尼龙膜先于5%冰乙酸中室温浸泡15 min。

5.  于0.5 mol/L 乙酸钠和0.04%亚甲蓝溶液中浸泡5~10 min。

6.  去离子水淋洗膜5~10 min，可见RNA标准及28s及18 sRNA的条带，软铅笔标记。

二、预杂交、杂交及显色

1.  Washing buffer润洗1遍（3~5 min）。

2.  100 ml blocking buffer工作液封闭30 min。

3.  100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。

4.  Washing buffer洗膜（15 min×2）。

5.  20 ml detection buffer 平衡2~5 min。

6.  将尼龙膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光数min至1天（出现颜色时不要摇动）。

7.  当出现条带时，TE-buffer洗膜（5 min×1），终止现色。

8.  照相记录，80℃烤干，储存。

9.  扫描计算EGFR基因扩增的倍数。

1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。

2. 凝胶中最好不要加入EB，以免降低杂交的效率。

3. 为降低膜杂交本底，可适当延长预杂交时间。