OsAGAP在拟南芥中的功能分析

实验概要

本实验对水稻小G蛋白ArfGTPase激活蛋白OsA GAP在拟南芥中的功能进行了分析，首先构建了OsAGAP在拟南芥中的正义表达载体，利用农杆菌介导的真空抽滤法转化拟南芥，筛选拟南芥阳性苗，然后用组织PCR和 Southern杂交做了检测。

实验材料

1. 所用拟南芥((Arabidopsis thaliana)生态型为C24，22℃，16h光照培养。

2. 菌株：大肠杆菌：DH5α；农杆菌：GV3101等。

实验步骤

1. OsAGAP在拟南芥中正义表达载体的构建

根据OsAGAP的cDNA序列设计5’端引物(F35XBASL)：5'-CT TCTAGA CCAGCC AGG AGA AAT CCA-3'(下划线序列为XbaI位点)，3’端引物(F35BAMH3R)：5'-TT GGATCC ATCC AC AAA TGA ACC AAG TTA ACA-3'(下划线序列为BamHI位点)，经XbaI/BamHI双酶切消化后，以正向插入到pBI121载体相应位置构成pBI121-OsAGAP表达载体。

2. 农杆菌介导的真空抽滤法拟南芥转化

   1) 农杆菌准备

      a. 接种含有表达载体的农杆菌克隆于5ml YEB培养基(含100ug/ml Rif，100ug/ml Kan)中，28℃，200rpm，振荡培养过夜；

      b. 按1:50的比例转接到200ml YEB培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀为3.12-3.16:

      c. 5000g，离心15min，收集菌体；

      d. 重悬于渗透缓冲液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 0396 Silwet L-77)，调OD*至0.8。

   2) 真空抽滤法转化

将拟南芥培养钵倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上，于干燥器中抽真空3-5min，缓慢放气，取出培养钵侧置于托盘中，用塑料薄膜覆盖托盘，24h后取下薄膜，于温室中继续培养。

3. 拟南芥阳性苗筛选

   1) 将收获的转基因种子用0.2%的TritonX-100浸泡l0min；

   2) 再用10%的次氯酸钠表面消毒，12min；

   3) 灭菌水洗涤五次，每2min一次；

   4) 用水将种子铺在含50mg/L Kan的MS平板上，4℃黑暗培养两天；

   5) 22℃，16h光照培养。经Kan筛选后仍然长势良好，真叶叶片及生长点呈深绿色且根部伸扎入培养基的幼苗即可初步确定为阳性苗。

4. 组织PCR

   1) 1 X 1 mm的组织，加入40ul 0.25N NaOH煮沸30s；

   2) 加入40ul 0.25N HCl和20ul buffer(0.5M Tris-HCl，PH8.0，0.25% NP40)。煮沸2min，弃液体部分。

   3) 加50ul PCR反应混合物。

5. Southern杂交

   1) 30ug的植物总DNA用适量的限制性内切酶(1ug/5unit )酶切过夜；

   2) 取少量的酶切产物检查酶切效果，酶切彻底的DNA在0.8%的琼脂糖凝胶电泳上电泳2-3hr；

   3) 凝胶在3.1.5 M NaCl和0.5 M NaOH变性45min；

   4) 切去凝胶的多余部分，通过毛细作用将DNA转移至尼龙膜((Boehringer Mannheim)上，转移buffer为20 X SSC；

   5) 转膜结束后，将膜用3.15 M NaCI和Tris-HCl (pH7.4)中和buffer中和45min；

   6) 尼龙膜晾干后于80℃烘烤0.5 -2hr，真空保存；

   7) 杂交前，将尼龙膜在5 X SSC中浸透后，转入预杂交液中，65℃下预杂交1-2hr；

   8) 探针随机标记(亦可用PCR标记)：反应体系为50ul。(标记好的探针经过柱纯化后在进行杂交，效果更佳)，反应前模板DNA热变性10 min，冰浴迅速冷却。反应时间为1 hr至过夜。

   模板    50 ng

   随机引物    1 ul

   Klenow(5u/ul)    1 ul

   5 X BufFer    10ul

   ³²P-dCTP    5ul

   dATP    1ul

   dGTP    1ul

   dTTP    1 ul

   ddH₂O    至终体积50ul

   9) 预杂交结束后，加入³²P标记的DNA探针，65℃下杂交16-20 hr；

   10) 杂交结束后，分别在高盐洗膜buffer(2 X SSC和0.5%SDS，室温5min)和低盐洗膜buffer(0.1 X SSC和0.5%SDS，65℃ 30min)下，各洗两次；

   11) 晾干后，X-光胶片进行放射自显影；

   12) -70℃曝光1-4天后，按常规洗片。

6. 扫描电镜观察

   1) 取茎尖于FAA (50%乙醇，5%乙酸，37%甲醛)，4℃固定2h；

   2) 梯度乙醇脱水，70%，85%，95%，最后换到100%乙醇中两次；

   3) 二氧化碳临界点干燥；

   4) 用双面胶粘在金属台上，离子溅射仪对材料喷金、镀膜；

   5) 扫描电镜观察。

7. 转基因拟南芥生理试验

将按上述方法筛选后的阳性苗转移到含有各种生长素、TIBA的I/2MS培养基上，对萌发苗的初生根、不定根长度、侧生根数目进行测量观察。每组实验设三个重复，每个重复共萌发10颗左右幼苗。