OsAGAP蛋白的ArfGTPase激活活性测定

实验概要

本实验诱导表达了Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白，纯化后测定了OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性。

主要试剂

1. GST融合蛋白纯化试剂盒(Pharmacia公司)

2. Enzcheck TM Phosphate检测试剂盒(Molecular ProbesCo.)

实验步骤

1. Arf-GST和OsAGAP-GST融合蛋白的诱导表达

参照Pharmacia公司的GST融合蛋白纯化试剂盒说明书进行。

   1) 将重组载体pGEX-4T-1-Arf，GEX-4T-1-OsAGAP以及作为对照的空载体pGEX-4T-1转入大肠杆菌BL21中；

   2) 挑取单克隆接种于LB培养基中，37℃培养过夜；

   3) 取过夜培养物按I/50的比例扩大培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃继续培养4h；

   4) 吸取lml培养物，离心收集菌体；

   5) 向菌体沉淀中加入100ulSDS样品缓冲液，混匀，煮沸3-5min，离心取上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测融合蛋白表达情况。

2. 酶溶法裂解细菌细胞

   1) 将IPTG诱导后的培养物，4℃，5000rpm，离心5min，收集菌体；

   2) 弃上清，按照每克细菌沉淀加入3ml裂解缓冲液的比例将沉淀悬浮(冰上进行)；

   3) 向悬浮液中加入蛋白酶抑制剂PMSF(50mM)及溶菌酶，搅拌20min，在搅拌过程中加入脱氧胆酸钠(冰上进行)；

   4) 溶液变得粘稠时，加入DnaseI，室温放置至溶液不再粘稠(冰上进行)；

   5) 4℃，12000g，离心15min，上清即为蛋白粗提液。

3. 用Glutathione Sepharose 4B进行融合蛋白的大量纯化

   1) 将Glutathione Sepharose 4B柱体事先用1 X PBS平衡，之后加入细菌裂解液上清:

   2) 室温下多次混匀，充分结合；

   3) 待Glutathione Sepharose 4B颗粒自然沉降之后，缓慢放出液体:

   4) 用10倍柱体积的1 X PBS清洗柱体，重复两次；

   5) 按每lml柱体积对应于1 ml洗脱液的比例加入洗脱液，室温孵育10min使洗脱液中的还原性谷肤甘肤置换柱体中结合的融合蛋白；

   6) 收集洗脱液；

   7) SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的纯化及洗脱效果。

4. OsAGAP蛋白的Arf GTPase激活活性测定

GTPase测定实验使用Enzcheck TM Phosphate检测试剂盒(Molecular ProbesCo.)完成，操作参照试剂盒说明书。

将反应混合物(1uM Arf-GST融合蛋白，0.2 mM GTP，0.2 ml MESG，10ul purine nucleotide phosphorylase，HEPES buffer)加入1.5 ml Ep管中，22℃温育20min，以除去体系中游离磷的污染。反应混合物加入比色皿中，加入250 nMOsAGAP-GST融合蛋白，360nm立刻读数，然后每5min读数一次，至30min，根据读数绘制标准曲线。以不加OsAGAP-GST融合蛋白反应体系作为活性测定实验的本底对照。