PCR产物的平末端克隆

噬菌体 T4 DNA 连接酶 噬菌体 T4 DNA 聚合酶 限制性内切核酸酶 闭环质粒 DNA 靶基因 DNA

ATP dNTP 溶液 KGB 广域缓冲液

琼脂糖凝胶 水浴箱

一、材料

1. 缓冲液与溶液

10 mmol/L ATP

2 mmol/L dNTP 溶液（含四种 dNTP）

10X KGB 广域缓冲液（1 mol/L 乙酸钾，250 mmol/L Tris-acetate ( pH 7.6 )，100 mmol/L MgAc ( 含四水化合物），5 mmol/L β-巯基乙醇，100 μg/ml 牛血清白蛋白）

2. 酶与缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

噬菌体 T4 DNA 聚合酶

用于克隆的限制性内切核酸酶

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 核酸与寡核苷酸

闭环质粒 DNA ( 50 μg/ml）

靶基因 DNA ( 25 μg/ml) 及 PCR 扩增产物

5. 特殊设备

水浴箱预设水温在 22℃

二、方法

1. 在一只微量离心管内，依次加入下列试剂，混匀：

50 μg/ml 闭环质粒载体      1 μl

25 μg/ml PCR 扩增靶 DNA 8 μl

10X KGB 广域缓冲液         2 μl

H₂O( 见下面注释）           5 μl

10 mmol/L ATP                1 μl

2 mmol/L dNTP                1 μl

限制性内切核酸酶            2 单位

T4 DNA 聚合酶                1 单位

T4 DNA 连接酶                3 单位

注意：用 H₂O 调整终反应体积为 20 μl 反应体系。

设置对照反应管，加入以上除了 PCR 扩增靶 DNA 的所有试剂。

2. 将连接反应混合液离心管在 22℃ 水浴温育 4 h。

3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H₂O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布于含适当抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。

4. 计算实验管与对照管在培养皿上的菌落数。

挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色单菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以用菌落 PCR 予以鉴定。

5. 通过琼脂糖凝胶电泳测定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker 分子量作对照）。

6. 利用 DNA 序列分析、限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。