PCR产物的直接纯化

实验概要

本实验介绍了PCR产物直接纯化的原理及操作步骤。

实验原理

PCR产物一般都含有过量的引物、Taq   DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。本实验中，Buffer  PCR-A促使大于100bp的DNA片断选择性地吸附到silica膜上。经Buffer W1、Buffer  W2洗涤去除残留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到silica膜上的  DNA片断经微量水或Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。

主要试剂

1. Buffer PCR-A

2. Buffer W1

3. 已加无水乙醇的Buffer W2

4. Eluent或去离子水

主要设备

1. 恒温孵育器（65℃）

2.离心机

3. 移液器

4. 1.5ml 离心管

实验材料

PCR产物

实验步骤

1. 在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，则加入100μl。
2. 将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，将步骤1中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm离心1min。
3. 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm离心1min。
4. 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加无水乙醇的Buffer W2，5500rpm离心1min，以同样的方法再用700μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
5. 弃滤液，将DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm离心1min。
6. 连滤液一并弃掉收集管，将DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 离心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去离子水（65℃预热）。
7. 室温静置2min，14000rpm离心1min洗脱DNA。
8. 取5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

注意事项

洗脱液预热后可增大洗脱的DNA量，同时重复洗脱也可增加溶解的DNA量。