PCR产物的TA克隆

实验概要

本实验介绍了DNA回收和连接的基本原理，PCR产物的T-vector克隆。

实验原理

1. DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2. 利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

主要试剂

1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)
2. TAE电泳缓冲液
3. 琼脂糖(Agarose)
4. 6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
5. 溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
6. 70%乙醇
7. 胶回收试剂盒(Omega公司)

主要设备

1. 水平式电泳装置

2. 电泳仪

3. 台式高速离心机

4. 恒温水浴锅

5. 微量移液枪

6. 微波炉或电炉

7. 紫外透射仪

8. 凝胶成像系统或其它照相设备

实验步骤

1. 胶回收试剂盒回收PCR产物(以Omega公司 Gel Extraction Kit为例)

   1) 当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
    2)  凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积(假设其密度为1g/ml)。加入等体积的Binding  Buffer(XP2)，于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3  min振荡混合物。(在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding  buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5  M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。)
   3) 取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干凈的2ml收集管内(已备好)。
   4) 将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。
    5)  如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind  DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。
   6) 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。
    7) 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash  buffer(已用无水乙醇稀释的)至柱子中。室温下10,000xg离心1min。(浓缩的SPW Wash  Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下)。
   8) 重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。
   9) 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。
    10) 把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，加入15~30μl(具体取决于预期的终产物浓度)的Elution  Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min,  13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

2. 连接反应(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例)

   1) 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
   dH₂Oup to 5 μl
   2) 加入5 μl(等量)的 Solution I。
   3) 16℃反应30分钟。(2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时)。
   4) 全量(10 μl)加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。
   5) 42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
   6) 加入890 μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。
   7) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
   8) 挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。

注意事项

1. 使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer。不要重复使用，其PH的升高会减少产量。
2. 不论采取何种方法回收DNA，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和浓度，以方便后续操作。
3. 从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光对DNA的切割。DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。
4. 连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16℃连接4小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。
5. 连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。
6. 连接反应应在25℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA，影响连接效率。长片段PCR产物(2kb以上)进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。
7. 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:2~10。根据实验情况选择合适的摩尔数比。
8. 用高效的感受态细胞(转化效率≥1×10⁸ cfu/μg pUC19)，这样才可能得到比较理想的阳性克隆。