PCR仪的测序反应试验讲解

　PCR仪进行测序反应试验时应按照步骤依次进行：

　　1.取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，加入规定试剂。总反应体积5μl，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。将PCR管置于PCR仪上进行扩增。98℃变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃10秒，50℃5秒，60℃4分钟，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。

　　醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物：

　　1.将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中；

　　2.加入25μl醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4℃离心30min，小心弃上清；

　　3.加70%（V/V）的乙醇50μl洗涤沉淀2次。12000r/min于4℃离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10-15min。

　　电泳前测序PCR产物的处理：

　　1.加入12μl的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心；

　　2.将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心；

　　3.在PCR仪上进行热变性（95℃2min），冰中骤冷，待上机。

　　具体上机操作按PCR仪说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳（1.2kV，20min），在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

　　仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

　　测序完毕按PCR仪操作规程进行仪器清洗与保养。