PCR的反应步骤

　　 聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。一般PCR反应由20到35个循环组成，包括以下步骤[3]：

　　1 变性：利用高温（93-98℃）使双链DNA解螺旋，高温使两条DNA链间的氢键断裂。在第一个循环之前，通常加热时间较长以确保模板DNA完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。

　　2 退火：将反应温度降低至50-65℃（通常比引物 值低3-5℃）持续20-40s，从而使引物结合于单链DNA上。若退火温度过低，容易造成非特异扩增，而退火温度过高，引物可能根本不结合。

　　4 延伸：此步骤的温度取决于所用的DNA聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的热稳定DNA聚合酶的最佳活性温度约为75–80°C，但通常使用的延伸温度为72°C。 在这一步骤中，DNA聚合酶通过从反应体系中添加的5'至3'方向的游离dNTP，从而合成与DNA模板链互补的新DNA链。延伸所需的精确时间取决于所用的DNA聚合酶和待扩增的DNA片段的长度。 传统的Taq 酶估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr 酶（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40s、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15s。有修正功能的则会比较慢。

　　4 上述循环结束后，将进入终延伸阶段：此步骤是可选的，但要在70-74°C）（PCR中使用的大多数聚合酶最佳活性所需的温度范围）下进行5-15分钟。 最后一个PCR循环，以确保所有剩余的单链DNA的冈崎片段被补齐。

　　5 最终保持：最后一步将PCR仪反应室无限期地冷却至4–15°C，可用于PCR产物的短期保存。