PCR基因扩增原理、材料和方法

一、原理
多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）类似于DNA 的天然复制过程：经过变性、退火、延伸多次循环（图1 ) , DNA 扩增倍数可达2 n 倍。即
Y = ( 1 + X ) n
式中，Y 为DNA 扩增倍数；X 为扩增效率；n 为循环次数
二、材料
（1）模板 DNA；PCR 引物；Taq DNA 聚合酶；dNTP ； PCR 缓冲液［20 mmol / L Tris -Hcl 缓冲液（pH 5.3 ) , 1.5 mmol / L MgCl2 , 25 mmol / L Kcl , 100 μg / mL 灭菌明胶或无核酸酶的牛血清白蛋白，0.05 % Tween 20 〕；石蜡油。
（2）乙肝病毒基因的PCR 检测试剂盒

（3） PCR 扩增仪。

图1 PCR 基本原理示意图

三、方案
1 、经典的PCR 扩增方案
经典的PCR 扩增方案为：
反应总体积 100μL
模板DNA 105 -106 个分子
PCR 引物 20 pmol / L
Taq DNA 聚合酶2U
dNTP 50 μmol / L
PCR 缓冲液
20 mmol /L Tris-HCI 缓冲液（pH8.3 )
1.5 mmol /L MgC12
25 mmol /L KCl
100μL 灭菌明胶或无核酸酶的牛血清白蛋白
等体积石腊油覆盖。
2、乙肝病毒基因的PCR 检测
1 ） 标本处理
PCR 的主要因素
1、模板DNA
单链、双链DNA 均可作为PCR 的模板。
DNA 样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶等的污染。
模板用量依具体实验而定，一般为100 μL 反应液有105 -10 6 个目标分子。
PCR 反应时模板变性要充分。
2、PCR 引物
PCR 引物设计是否成功是能否获得高质量PCR 产物最关键的因素之一。在设计和应用时，需注意以下重要环节：
（1）一对PCR 引物相互之间的3 '末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。
（2）要避免引物分子内序列自互补
（3）引物的熔点温度（Tm 值）。 Tm 值与引物的碱基组成和长度有关；PCR 引物的GC / AT 应与要扩增的模板DNA 相当或略高些。一般熔点温度以大于55 ℃ 为宜。
（4）一般来说，PCR 产物≤500 bp 时，引物长度选择16-18 bp；PCR 产物≥5kb 时，引物长度选择24 bp 左右为宜。
（5）引物的3 '末端必须与模板严格互补，而5 '末端的要求可灵活些。
（6） 设计的引物应通过计算机软件对引物二聚体形成、自身互补性及特异性进行分析。
（7）用于亚克隆的引物，常在引物的5 '端加上限制性内切核酸酶位点。为了保证内切酶有效酶切扩增产物，一般在酶切位点的5 '端再加上几个额外的碱基。
3、热稳定DNA 聚合酶（如Taq DNA 聚合酶）
一般用量为2.5U / 100 μL。酶量过多易导致非特异性产物的产生。
该类酶的最适温度为75 ℃ ，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物一模板的非特异延伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。
4 、dNTP
PCR 常用的dNTP 浓度在50-200 μmol / L 。可根据具体实验来确定最适的dNTP 浓度。
5 、PCR 缓冲液
因PCR 反应中的dNTP 能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+浓度，所以应按不同条件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR 反应中（dNTP 浓度200μmol / L ) , Mg Mg2+浓度约为1 .5mmol / L。
6 、PCR 循环的温度
预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94 ℃ 3 -5 min 。变性不完全时，DNA 双链会很快复性，影响PCR 反应，但若变性温度太高（不宜超过95 ℃ ），会影响Taq 酶活性。
变性：一般为94 ℃ 30s 或95 ℃ 20s 。
引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定，一般为50-72 ℃ 。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3 '端不正确核苷酸的错误延伸。
延伸：一般为72 ℃ 60 -90s 。最后一个循环后应在72 ℃ 保留5 min ，以保证PCR 产物合成的完整性。
7 、平台效应和PCR 循环的次数
在PCR 的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲线，即所谓平台效应。它的出现是由于PCR 原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的。所应选择合理的循环次数，既能得到足够量的PCR 产物，又不要无意义地增加循环次数。
8、操作环境
避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA 的污染等