PCR基因芯片上荧光PCR反应的研究（二）

1.3.2  PCR-SSCP方法分析按照我室常规进行。

1.3.3  Taqman荧光探针 以发现的ALAS2基因第五外显子点突变为中心设计，序列如下： 5’ （荧光集团）FAM-CAAGATCATAGAGAAGAAAC- TAMRA（淬灭集团） 3’，设计Taqman荧光PCR反应的上下游引物。序列如下：上游引物:5’-tcagttatgaccagtttttcaggg-3’，下游引物:5’-gaacacacggtaggtgtgatcct-3’

1.3.4  常规实时定量PCR检测ALAS2基因第五外显子基因突变 在GeneAmp ®SDS 5700荧光PCR仪上进行，反应条件50℃0C 2分钟，94℃ 10分钟，然后94℃ 30秒，60℃ 30秒共40个循环

1.3.5  PCR基因芯片上进行PCR反应  
用0.5ml清洁医用注射器缓慢吸取Taqman荧光PCR反应液。刺破芯片表面PVC封膜，沿加样孔缓慢将反应液加入，用透明胶带封住加样孔。将芯片放入Gene Amp PCR System 2400 PCR仪，行PCR反应，探索不同反应条件。

1.3.6  PCR基因芯片上的PCR产物检测  在共焦显微拉曼光谱仪(Renishaw 1000)上检测荧光。将芯片置于显微镜的载物台上，在普通光源照明下，调节载物台的垂直位置，使待探测的芯片上表面位于20X物镜的焦平面上。再调节载物台的水平位置，使反应池位于目镜视野的中心。激发光源为氩离子激光器的488 nm线，检测方式是背反式。
1.4  PCR基因芯片上应用SYBR Green荧光染料
1.4.1 普通PCR反应检测20例正常人HLA-A2与非A2   应用4步位点特异性PCR反应初筛正常人HLAA2与非A2，4步反应引物如下(表1)
［8］：PCR反应条件按照本室常规。
表1检测HLAA2与非A2 SCP反应引物


1.4.2  用SYBR Green荧光染料做常规实时定量PCR  在GeneAmp ®SDS 5700荧光PCR仪检测进行PCR反应初筛HLAA2与非A2，与普通PCR做对照。SYBR Green荧光PCR反应条件: 94℃ 3分钟，然后94℃ 1分钟、退火温度1分钟、72℃ 1分钟共30个循环，72℃ 延伸5分钟。第一步反应的退火温度为63℃,第二步、第三步反应的退火温度为65℃、第四步反应的退火温度为64℃。  
.1.4.3  PCR芯片上进行SYBR Green荧光PCR反应  PCR反应法同Taqman荧光PCR，探索不同反应条件。
.1.4.4 在共焦显微拉曼光谱仪(Renishaw 1000)上检测荧光（方法同上）

2．结果

2.1  本次试验的PCR基因芯片（21.3 mm ´ 17.5 mm）由192个微反应室组成，可以同时进行192个不同的PCR反应。芯片的长方体微反应室的长度为700um，宽度为600um，深为200um，体积约为35nl。每两个微反应室之间的间距为1200um。微反应室之间由通道相连并汇集形成与外界相通的3个端口。其中较大的一个是供加入反应液用，其他较小的两个是为了能够排出气泡与过量的反应液。加样端口为主流道，又分为很多次流道，每个微反应室的入口与出口就与次通道相连，主流道宽140um；次流道宽50um。微反应室与流道腔的深度分别达到200um与50um。芯片进行热氧化后表面的亲水性增强，反应液可以在芯片内顺利流动。PVC聚合物压合封闭芯片，因为PCR芯片需要事先在其表面点入若干DNA样本或引物，封闭材料不仅有良好的导热性、密闭性、对PCR反应无抑制且在封闭过程中不能对点入的DNA样本有损。