PCR干扰实验的设计思路

之前一系列的文章已经涵盖了荧光定量PCR的检测试剂评价、提取试剂评价和PCR仪器的评价（检测系统评价系列）。但是这仍然解决不了临床上遇到的所有问题，干扰试验也是大家比较关心的一个热点。我试着根据已有的标准来分享下我对于PCR干扰实验的设计思路。

一、PCR试验的干扰物

1.内源性干扰物 endogenous interferent

体内样品中出现的物质，可干扰对其他物质的检测。

血液：血红素（>1mg/ml），氯高铁血红素(>0.1ng/μl)，甘油三酯，IgG等；

尿液：尿素（20mM）；

粪便：植物多糖、胆酸盐；

组织：蛋白酶、胶原蛋白；

奶：蛋白酶、钙离子；

药物：抗生素、抗病毒药、激素类等。

其他。

2.外源性干扰物 exogenous interferent

来自于体外可干扰其他物质的检测的物质。样本添加剂及在样本采集与处理过程中可与之接触的物质：

试验用品：血清分离胶，样本采集容器及胶塞、导管、导管冲冼液、手套粉末等。

抗凝剂：肝素（>0.1 U/mL）、EDTA（>0.5 mM）等；

有机溶剂：异丙醇（>0.1 IU/ml）、甜菜碱、二甲基亚砜、甲酰胺、甘油、PEG等；

消毒剂：醇类（乙醇>1%）、醛类、酚类（苯酚>0.2%）、过氧化物类、强酸（HCL）、强碱（NaOH）等;

去污剂：SDS（>0.005%）;

土壤：腐殖质

染料：靛青

其他。

在实际的户外采样条件下，如采集环境样品，样品中可能含有多种干扰物，并且每个场所的干扰物组成都各不相同，这就需要因地制宜的开展PCR干扰实验。

二、干扰物的试验浓度

干扰物的实验浓度确定原则

三、干扰物样品的制备

1、基础样本

干扰物质的纯品多为固体，需要用适当的溶剂将其溶解，制成干扰物原液。如所用的是药品级制品，应注意所含赋形剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、着色剂、调味剂、金属氧化物、填充物等对检测结果造成的影响。

溶剂应使干扰物充分溶解且不会影响检测结果。常用溶剂有纯水、HCl 或NaOH溶液、乙醇或甲醇、丙酮、二甲基亚砜等。

原液浓度应至少20倍于实验浓度，以减少对基础样本基质的稀释。应注意防止有机溶剂的挥发并考虑其在水中的溶解度。