PCR异常扩增曲线分析攻略（一）

发布时间：2021-06-23 15:45 原文链接： PCR异常扩增曲线分析攻略（一）

近几年，从科学研究到临床检测，从“非洲猪瘟”检测到“新冠病毒”检测，荧光定量PCR仪器已成为分子生物学研究的常规设备。检测方法的迅速发展，检测任务的紧急也对检测人员提出了更高的要求，需要他们具备熟练判断数据结果的能力。对于荧光定量PCR的结果的判断，最直观的判断就是看扩增曲线是否正常。很多老师在平时实验中会遇到异常扩增曲线的困扰，比如打折的扩增曲线、复孔间重复性不好、阴性样本扩增曲线抬升等。面对异常的扩增曲线，大家也不用担心，接下来我们会结合几个实例，带着大家一起来看一下比较常见的异常扩增曲线的分析攻略。

1 确认软件设置是否正确

对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。有一个比较容易忽略的设置问题是，需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。Applied Biosystems^TM系列荧光定量PCR 仪器可以用ROX来作为参比荧光染料，用以校正仪器系统以外的物理误差，比如均一化校正由于移液误差或者蒸发导至的批内体积误差等。

目前市面上有的的荧光定量PCR预混液是不含有ROX的，当用此类试剂的时候，应该将ROX参比功能关闭，否则可能会出现图一左图所示的，扩增曲线异常的现象。遇到这种问题，可以在Plate Setup设置中找到Passive Reference，把ROX改为None，重新分析一下，结果就变正常了（图一右图）。Applied Biosystems^TM系列荧光定量PCR 仪器默认是对所有荧光通道及所有样品孔进行荧光采集，用户不用担心数据丢失，实验完成后，还可以对设置错误的反应孔的荧光通道、样品名称等进行更改。

图一：使用不含ROX试剂，忘记更改Passive Reference结果图及更改后的结果图

还有一些结果，多组分图扩增曲线没有抬升，是很明显的阴性样本，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样就会与阈值线相交，反而有了CT值。这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升（图二）。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第25个循环，那基线的终点就是24）。引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导至背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误。