PCR技术的发展（下）

接着上期，我们继续回到故事里面。

关于Mullis发现PCR的过程，比较公认的版本是，有一天他驾车开过蜿蜒山路的时候，开始琢磨他的检测单碱基突变的方法。这一次他想到的点子是，既然结合一条引物是可行的，为什么不试试看同时结合两条引物呢。于是Mullis开始在脑海里模拟这个实验：设计两条引物，分别结合在DNA的正义链和反义链上，且这两条引物的3’端均位于待测碱基的上游1个碱基的位置。这样，当进行Oligomer Restriction检验的时候，两条链上都会延伸结合上相应的ddNTP。只需要在原先设计引物的时候将两个引物的长度设计得不一样，得到的两个产物就能够在DNA胶上被区分开来。这样，一次检测就能同时得到两个结果，这两个结果可以互为对照组，如果两条链的结果得到的碱基可以互相配对成功，那么证明实验体系没有问题，结果可信；反之，如果两条链结果不一致，那么很有可能是实验过程中出现了问题。

Mullis开始模拟实验：如果混入了dNTP，那么聚合酶在延伸DNA链时则会有时用dNTP有时用ddNTP，使得ddNTP结合的位置就变得不确定，通过他的对照组的设计就能够检测出来，该组实验结果不能采信。很好，对照组的效果不错。那么，有没有什么办法可以避免dNTP的混入呢？比如用碱性磷酸酶（BAP,Bacteria Alkaline Phosphate）呢？用BAP除去原有混合物里面的磷酸基团，随后再加入ddNTP开始反应，这样应该不错。不过得想个办法在加入ddNTP之前除去BAP的活性。

由于一时想不到好的解决办法，于是Mullis便开始想，那么就先这样吧，让那些混入的dNTP先留 在反应体系里面，看看会发生什么事。于是，在那条漫长的公路上，他又开始继续他的思维模拟实验。这一次，他碰到了真理——PCR。当Mullis继续想着他的模拟实验的时候，他距离真理已经越来越近了。如果原先的反应体系里面混有dNTP，那么不妨先加入DNA聚合酶让反应发生，这时dNTP就会被作为原料完成DNA复制的反应；而此时只需要加热使DNA双链变性，再冷却复性时由于引物的量很多，因此原来的DNA链与引物结合的可能性最大，这样就达到了去除dNTP的目的。但是，如果dNTP的量比较多，延伸得比较长，使得变性复性之后，新合成的链与下游的反向引物结合了呢？  

EUREKA（找到了）！这样也没有关系，不就是模板链加倍了吗！单碱基突变检测照常进行！那么我可以有意多加引物保证模板链复制以提高效率！如果像这样一遍一遍重复，那么模板DNA就可以不断复制扩增了！单碱基检测的效率就大大提高了！

于是Mullis开始给Cetus其他的科学家们讲他的想法，但是除了他的女友Jennifer以及为数不多的几个技术员之外，其余的人都对他的想法并不感兴趣。不过同时，他的同事们也并不能从他的设计里面挑出任何漏洞。也就意味着，很有可能方案可行。

接下来就是实验验证了，在实验中他也经历了一些挫折。终于在1984年Mullis和Cetus公司对于PCR技术申请了技术ZL，并且撰写了文章发表。由公司撰写的关于PCR技术应用的文章很快在Science上刊发，但是由于种种原因，Mullis撰写的PCR原理的文章先后被nature和Science拒绝，最后只能发表在不知名的Methods of Enzymology （《酶学方法》）杂志上（真是天大的遗憾啊，估计此时nature和Science肠子都悔青了！）。

写到最后，回顾PCR发明的科学历程，还是非常有趣的。通常我们研究一个科学问题的思路，是提出一个重大的科学问题（Question），找到一个适合的研究体系（System），并借助于相关的技术（Technique）进行实验探索与猜想验证。如果不是这个思维极度发散，同时又善于抓住重要问题的“科学怪才”，即便是好点子送上们来也只怕会擦肩而过了。