PCR测序方法你知道几种？（一）

自从 Sanger等(1975)引人双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止剂,DNA序列测定技术得到迅速发展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通过其5三磷酸基团可以掺入到正在延伸的DNA链中,但由于其脱氧核糖3位置缺少一个羟基,因此不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,使得DNA链的延伸被终止。根据此原理,在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入一定比例的一种 ddNTP,dNTP参与的链延伸将与ddTP参与的链终止发生随机竞争,最终反应产物是一系列的寡核苷酸链,其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的dNTP,结果将产生4组寡核苷酸链,它们将分别终止于模板链的每个A、C、G或T的位置上,通过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。

PCR测序根据标记的方式不同和循环的次数不同可分为直接测序法和循环测序法。

直接测序法 

一、原理

PCR扩增获得双链DNA产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低dNTP浓度),通过DNA聚合酶催化作用延伸20~80个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的dNTP,能使新合成的DNA链中含有多个放射性标记,便于产生高放射显影度。标记的DNA链在高进行性反应条件下,通过DNA聚合酶催化进行延伸,通过在反应体系中掺入 ddNTP,使链延伸反应终止。反应产物经过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。

二、材料

(1)DNA模板PCR产物离子交换色谱纯化,作为DNA模板,浓度为:0.01~0.1mmol/L。

(2)引物20个核苷酸的DNA引物可以不经过纯化,直接用作测序引物,引物浓度 l mmol/L

(3)DNA聚合酶要求该酶在低温条件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA链中掺入放射性标记。比如USB/ Amersham公司生产的测序酶2.0。

(4)测序反应缓冲液根据测序酶具体而定,如测序酶2.0的反应缓冲液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl.

(5)放射性标记的dNTP一般为[aP]dATP、[a3P]dATP或[a3S]dATP。

三、方法

(1)制备链延伸终止反应混合物分别在4个微量离心管中各加入一种 dNTP/ddNTP的混合物2.5,其中dNTP和dNTP浓度分别为80m0/L和8pmol/L,37℃预热5mine

(2)制备退火混合物在一个微量离心管中加入PCR扩增DNA1pmol,测序引物1012p5×测序反应缓冲液,用水调整至总反应体积10pl

在加热仪内94~96℃加热8min后,迅速放入冰浴中冷却lmin(适合于双链DNA模板),或者在加热仪内65℃加热6min后在加热仪内自然冷却到30℃(适合于单链DNA模板)。

1000r/min离心10s后在冰浴中冷却,并迅速进行下一步操作。

(3)标记反应在退火混合物中加入2l预冷的dNTP混合物(含dTTP、dGTP和dCTP各0.75mol/L,5C的[a2P]dATP),1plo.1mol/LDDT,现稀释的测序酶2U,并用水将反应体系调整到15.5,混匀后在冰上孵育2min,放射性标记新合成的DNA链。

(4)链延伸终止反应将3.5标记混合物分别加入4管链延伸终止反应混合物中,37℃进行链延伸终止反应5min。

(5)终止反应体系在各管中加入4终止液(95%甲酰胺,20mmo/ L EDTA,0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯腈蓝FF),终止反应。样品可以一70℃保存2~7d。电泳前在电热仪上80℃加热3min。

(6)电泳分离和放射自显影每一泳道上样2~3μl,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

P标记的需要过夜曝光显影,若用P标记的需要2~3d曝光显影,读片。

四、注意事项

①标记反应最为关键,应在低进行性反应条件下进行。退火后引物只被延伸20~80个核苷酸,并在新合成的DNA链中掺入多个放射性标记。对高GC碱基含量的DNA模板,可用[aP]dCTP代替[aP]dATP。

②对高GC碱基含量的DNA模板,链延伸终止反应混合物中应用7-脱氧2dGTP替代dGTP,以消除电泳过程由于压缩现象产生的假带。

循环测序法 

一、原理

循环测序法是利用热循环仪高效的自动循环能力,使链终止的序列产物以线性方式获得扩增,从而产生高显影度的序列梯度。首先将PCR扩增的DNA经变性形成单链形式,使标记引物(P、生物素或荧光标记)与其中的一条链上的互补序列退火。退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。由此产生的模板链与延伸终止链形成的部分双链产物在下一轮测序循环中,再次被变性,释放出模板链,作为又一轮引发反应的模板,同时积累下每轮循环产生的链终止产物。这种循环步骤重复20~40次,使链终止产物以线性方式扩增。

与直接测序法相比较,循环测序法有如下优点:所需的模板DNA量少;在高温下进行,可使DNA聚合酶催化的聚合反应能够通过模板二级结构的区域;多轮的变性步骤便于对质粒DNA、ADNA、黏粒DNA和PCR产物等双链DNA模板进行测定,不需要经过一个单独的变性步骤而直接进行测序。

二、材料

(1)模板可用PCR扩增好的DNA作模板,也可使用低浓度的dNTP(10~20mol/L)和引物(1mmol/L)来进行靶DNA的PCR扩增,然后直接用PCR产物作为模板。DNA模板浓度:0.01mmol/L

质粒DNA模板用质粒纯化试剂盒提取。对于高拷贝数的质粒可以直接从菌落中获得测序。测序反应的质粒典型用量:50~200mol

其它模板(M13、黏粒及ADNA)的制备为常规分子生物学手段。M3和ADNA作为模板用量:10~100mo黏粒DNA作为模板用量:50~200mol