PCR组装反应

氯化镁 Rockstart 缓冲液 three-reaction 主混合液 琼脂糖凝胶

PCR 仪 PCR 管

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

氯化镁,35 mmol/L

Rockstart 缓冲液（http://klentaq.com)

three-reaction 主混合液

82ul 5mol/L 的甜菜碱

3.2ul 每一种浓度为 10 mmol/L 的 dNTP 混合物

1ul Klentaq LA 酶混合物（Clontech 8421-1)

6.3ul 左侧 PCR riboprimer(储存液浓度10umol/L)

6.3ul 右側 PCR riboprimer(储存液浓度 10umol/L)(没有模板）

153.5ul H₂0 补至总体积 252ul

2. 凝胶

琼脂糖凝胶，1.4%

3. 特殊设备

PCR 仪

PCR 管

二、方法

1. 向 3 个 PCR 管中都加入 10ul Rockstart 缓冲液和 10ul 35 mmol/L 的 MgCl2，让加入成分静置混合至少 15 min 以形成镁沉淀（BarnesandRowlyk2002)。

2. 准备 three-reaction 主港合液。

3. 在铁沉淀形成之后，向每个包括 Rockstart 沉淀的反应管中添加 80ul 的 three-reaction 主混合液。

4. 加入 1ul 或2ul的 40mer 的混合物，浓度是每种 40mer lpmol/ul。混合与否并不重要。以 93°C 1 min、62°C 20 min 进行 25 个循环。

5. 在 1.4% 的琼脂糖凝肢电泳分析 15ul 的 PCR 产物。